烟草、烟草种子及烟草制品 DNA 鉴别检测方法技术报告

I烟草、烟草种子及烟草制品DNA鉴别检测2环境、检测人员主观感受差异、加工条件、烟草组织器官变化及不法分子人为染色加料等因素的影响，鉴别检测的准确性还有待于进一步提高。上述原因造成了烟草质检机构出具的烟丝、烟沫、烟梗等形态样品的鉴别检测报告偏少的局面；烟草种子是烟叶生产的基础物资，是烟叶生产质量保障的最初环节，其质量好坏和稳定对烟叶生产影响重大，因此对其进行鉴质认定管理改革工作，拟推行资质认定清单制，正面清单中只保留国家标准、行业标准、技术规范和国际标准（ISO、IEC、ITU）中的方法，对规范性文件、企标和国外标准、实验室方法等不再作为资质认定依据。本次改革事关行业质检机构的资质认定，涉及到了卷烟、雪DNA鉴别检验方法》和Q/CTQTC138《烟草种子烟草于实验室方法，不在正面清单中。为了保障行业专卖打假打私工作的顺利进行，烟草质检机构应提供有效且权威的技术支撑服务，因此，国家局紧急下达了相关鉴别检测方法行业标准DNA分子标记技术属于分子生物学研究范畴，是从DNA水平区分不同物种甚至是同一物种不同个体之间的选择性标记技术[1-4]，以被检样品的DNA序列信息为基础，因此品外观、外界环境、检测人员主观感受差异、加工条件等因素的影响，适宜于在烟草、烟草种子及烟草制品鉴别检测中推广应用。目前DNA分子标记技术得到很好的区分，因此DNA分子标记技术作为物种分类鉴定的一种手段，已被广泛地应用于属间、种间、品种间的分类鉴定和亲缘关系研究中，几乎可以对所有的生物种类进行分类3考虑到烟草与非烟草、烤烟与非烤烟的鉴定对于烟草、烟草种子及烟草制品检测工作的重要性，优先进行了相关的研究工作：从美国国立生物技术信息中心（NationalCenterfor筛选出扩增长度适宜的、所有可能的SSR，将相关的引物分别与其它茄科植物和不同类别烟），鉴定，SSR-3、SSR-4用于烤烟与非烤烟鉴定）。在部分烟草制品的鉴别检测中，烟草DNA是否是外加（外源）的，对相关案件的审判有着很大的影响，因此在本方法的研究中，又进定种质由国家烟草基因中心提供；烤烟、白肋烟、晒烟和香料烟标准样品由国家烟草质量监督4以柱式植物DNA提取试剂盒（康润生物）提取相关生物样品DNA；EDTA、乙酸等均）；PCR扩增实验在AppliedBiosystemsVeriti®96-WellFastTher试样离心采用Eppendorf离心机；电泳实验采用Bio-RadUNIVERSAL凝胶电泳仪；DNA浓所有可能的SSR，将相关的引物分别与其它基因组进行比对，挑选比对不上的引物无菌水洗脱，一共5次，每次2mL，收集最后一次滤液及残渣。取滤液，提取DNA准备适合的育苗盆，在育苗盆里装入适量的混合均匀营养土(草炭、珍珠岩、蛭石比例），小时，随后灭灯培养8小时；待种子长出嫩芽后，将所有嫩芽采5说明书方法进行DNA提取，最后用Nanodrop2000分析仪测定DNA浓度和质量。经适当稀式植物DNA提取试剂盒说明书方法进行样品DNA提取，最后用Nanodrop2000分析仪测定为保障标记能够鉴定烟草非烟草，选用近缘物种番茄、土豆、辣椒、茄子等茄科植物和6由于该标记结果比较明确，进一步对该标记的鉴定效果进行了实验验证，从进证结果可以看出（图2），该标记对不同遗传背景的9个样品进行扩增，所有烟草样品的扩增带型一致（约200bp处），进一步说明该标记可用来进行烟草非烟草鉴定。7凝胶电泳进一步验证结果浆19.夜香树20.挂金灯21.灯笼行了验证实验，同时也加上了茶叶的验证实验结果（图3）。结果表明，所有烟草样品均能扩出明显的特异性条带（约200bp处），该从图4电泳结果可以看出，所有烟草样品均能扩出明显的特异性条带(8由于该标记结果比较明确，进一步对该标记的鉴定效果进行了实验验证，从进一步证结果（图5）可以看出，该标记对不同遗传背景的9个样品进行扩增，所有烟草样品的扩增带型一致（约150bp处进一步说明该标记可用来进行烟草非烟草鉴定。凝胶电泳进一步验证结果浆19.夜香树20.挂金灯21.灯笼为了进一步验证SSR-2在烟草非烟草鉴定中的可靠性出明显的特异性条带（约150bp处该条带在其它茄科植物与茶叶样品中均未见扩出，验9图7（1）SSR-1特异条带测序结果2）SSR-1特异条带序列在NCBI库中位置示意图图8（1）SSR-2特异条带测序结果2）SSR-2特异条带序列在NCBI库中位置示意图测序结果表明，SSR-1和SSR-2对所有烟草样品的扩增特异电泳图13（1）SSR-3特异条带测序结果2）SSR-3特异条带序列在NCBI库中位置图14（1）SSR-4特异条带测序结果2）SSR-4特异条带序列在NCBI库中位置测序结果表明，SSR-3和SSR-4对所有烤烟样品的扩增特异电泳条带序列相同，最终验的烟草提取液和非烟基质混合物的电泳结果，结果表明，不同质量比的混合物都可以扩增出烟草特异条带，而洗脱后的混合物（9泳道）未扩增出烟草特异条带，这说明我们所设计的洗脱步骤可以完全把外源性DNA洗脱干净，这时如待检样品再扩增出烟草特异条带，则说）；