附件3：两面针5种成分含量测定 高效液相色谱一测多评法（征求意见稿）  编制说明

团体标准《两面针5种成分含量测定高效液相一测多评法》（征求意见稿）编制说明一、项目来源本标准由广西壮族自治区药用植物园提出，深圳市中药制造业创新中心有限公司、华润三九医药股份有限公司和广西广林正山药业有限公司共同参与编制，经广西中药材产业协会批准立项，列入广西中药材产业协会2023年第3批团体标准制定项目计划。二、项目背景和目的意义背景：两面针为芸香科（Rutaceae）花椒属（ZanthoxylumL.）木质藤本植物两面针（Zanthoxylumnitidum(Roxb.)DC.）的干燥根，具有活血化瘀、行气止痛、祛风通络、解毒消肿的功效，可用于跌扑损伤、胃痛、牙痛、风湿痹痛、毒蛇咬伤及烧烫伤等。两面针作为一味传统中药，药用历史悠久，效果显著，经济价值高，是三九胃泰、正骨水、金鸡胶囊、两面针牙膏等医药、化工产品的重要原料。因此，两面针药才的质量、临床疗效和安全性备受关注。目前《中华人民共和国药典》（2020年版）规定两面针药材中氯化两面针碱含量不得少于0.13%。但两面针成分复杂，含有生物碱类、黄酮类、香豆素类、倍半萜类、木脂素类等多种化学成分，因此，制定一套科学、全面、高效的两面针多种成分质量检测标准显得尤为必要。目的：一测多评技术可以在一次测定中实现多个成分定量分析，即降低成本又提高效率。标准编制工作组利用高效液相色谱检测法与一测多评分析方法建立同步测定两面针中5种成分的标准操作规程，实现对两面针质量全面评价，以解决传统测定方法中存在的评价指标单一、成本高等问题，为临床用药提供更加安全、有效的保障，能更好地满足大规模生产和临床应用的需求。意义：全面评价两面针整体药材质量，保障临床用药安全、推动中医药行业健康发展，也为更多从事中医药研究和使用两面针的人士提供参考依据和指导作用。三、项目编制过程（一）成立标准编制工作组团体标准《两面针5种成分含量测定高效液相一测多评法》项目任务下达后，由广西药用植物园牵头，深圳市中药制造业创新中心有限公司、华润三九医药股份有限公司和广西广林正山药业有限公司共同参与成立标准编制工作组，开展标准研制工作。标准编制工作组一共15人，名单见表1。表1标准编制工作组人员与分工姓名性别职务/职称工作单位责任分工朱艳霞女高级工程师广西壮族自治区药用植物园标准编制组组长，全面负责标准起草组工作乔丽娅女助理研究员广西壮族自治区药用植物园参与含量测定试验、数据分析、标准草案等编写胡凤云女高级工程师广西壮族自治区药用植物园参与含量测定试验、数据分析、编制说明编写彭玉德男高级工程师广西壮族自治区药用植物园前期技术调研、收集与鉴定两面针药材样品、标准草案编写夏祥华男高级工程师广西壮族自治区药用植物园参与数据处理与验证张占江男研究员广西壮族自治区药用植物园参与标准方案与框架构建徐永莉女主任药师广西壮族自治区药用植物园参与标准草案编写付金娥女研究员广西壮族自治区药用植物园参与编制说明编写张洪胜男中药资源研究二级工程师/农艺师深圳市中药制造业创新中心有限公司前期技术调研、参与确立标准框架马庆男中药资源研究项目总监/制药高级工程师深圳市中药制造业创新中心有限公司前期技术调研、收集两面针药材样品陈剑洪男中药资源研究二级工程师/主管中药师华润三九医药股份有限公司前期技术调研、收集两面针药材样品刘光快男总经理/农艺师广西广林正山药业有限公司前期技术调研、参与确立标准框架陆日文男副总经理/工程师广西广林正山药业有限公司收集两面针药材样品唐真郎女经理/工程师广西广林正山药业有限公司收集两面针药材样品李浩通男经理/助理工程师广西广林正山药业有限公司收集两面针药材样品（二）收集整理文献资料标准编制工作组经查阅，收集了国内有关两面针成分含量测定方法的相关文献资料。主要有：《中华人民共和国药典》2020年版；《广西壮族自治区壮药质量标准》第一卷（2008年版）；《广西中药材标准》第二册（1996年版）；《香港中药材标准第五期》（2012年版）；《广东省中药材标准》（2011年版）；《湖南省中药材标准》（2019年版）；《上海市中药材标准》（1994年版）；《贵州省中药材质量标准》（1988年版）。《广西壮族自治区壮药质量标准》第一卷（2008年版）。（三）研讨确定标准主题内容标准编制工作组对收集到的资料进行整理研究后，组织召开了标准编制工作会议，对标准的整体框架结构进行研究分析，并对标准的关键性内容进行了初步探讨。经工作组研究确定，标准主体内容主要包括：术语和定义、原理、试剂、仪器、测定步骤、结果计算、精密度。（四）编写标准草案及征求意见稿2024年1月，在前期研究工作的基础上，理清逻辑脉络，整合现有资料中有关两面针的5种成分的检验方法，按照简化、统一等原则编制完成团体标准草案及其编制说明。标准草案编制后，标准编制工作组多次组织召开座谈会，就标准文本主要技术内容进行讨论，收集标准修改意见，会后根据座谈讨论情况对标准草案进行反复修改完善，最终形成团体标准征求意见稿及其编制说明。四、标准制定原则（一）实用性标准内容符合当前两面针药材质量标准和检验方法技术发展方向，满足两面针市场需求，标准条款切实可行，具有较强的实用性和可操作性。（二）协调性本标准编写过程中尊重知识产权，同时注重做好与相关法律法规、强制性标准的衔接，在内容上与现行法律法规、强制性标准协调一致。（三）规范性本标准严格按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草，标准涉及的专业术语、方法原理、试剂和材料、仪器和设备、测定步骤、结果计算等内容表达准确，引用数据、检验方法来源真实可靠，指标科学、论证充分，标准质量有保证。（四）前瞻性本标准在充分考虑当前中药材市场需求、试验标准品研制及成本问题的基础上，体现了特色性和先进性条款，为两面针药材及其制剂质量控制研究提供技术支撑和指导。五、标准主要内容及依据来源（一）术语和定义1、一测多评法Quantitativeanalysisofmulti-componentsbysingle-marker通过中药有效成分间存在的内在函数关系和比例关系,通过测定中药中某个代表性成分的含量，依据相对校正因子可计算出该中药中其他多种待测成分的含量，使其计算值与实测值符合定量方法学要求的一种多指标同步质量控制方法。2、相对校正因子Relativecorrectionfactor是一种修正因子，它的主要作用是修正测量值，以获得更准确的实验数据，提高研究质量，它的计算公式为某组分的绝对校正因子与标准物质的绝对校正因子之比。（二）方法原理在同时测定两面针多个指标质量成分的含量时，以两面针中典型成分氯化两面针碱做内参物，分别求出内参物与木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱、白屈菜红碱等其它4个待测成分间的相对校正因子，并把相对校正因子作为一个常数用于相应成分的含量测定。（三）仪器设备Agilent1260Infinity型高效液相色谱仪（四元泵、自动进样器、二极管阵列检测器、柱温箱，美国安捷伦公司）；Cary50型紫外分光光度计（美国Varian公司）；KQ5200E型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；CP225D型电子分析天平（十万分之一，德国Sartorius公司）。（四）试剂盐酸血根碱标准品（批号510001-201101，纯度99.3%）购自中国食品药品检定研究院；氯化两面针碱标准品（批号110848-200603，纯度99.2%）购自中国食品药品检定研究院；白屈菜红碱标准品（批号111718-201402，纯度80.5%）购自中国食品药品检定研究院；橙皮苷标准品（批号160406，纯度98.0%）购自北京博艺汇科生物技术有限公司；木兰花碱标准品（批号P11A10L85442，纯度98.0%）购自上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯（美国赛默飞世尔科技有限公司）。（五）实验方法1、色谱条件AgilentEclipseC18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相20%乙腈-0.1%甲酸（三乙胺调节pH至4.5）；体积流量1.0mL/min；柱温30℃；检测波长273、284nm；进样量10μL。2、制备标准品溶液精密称取氯化两面针碱、木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱和白屈菜红碱标准品分别约1.25mg、5mg、5mg、1.25mg和5mg，加70%甲醇溶解并定容至25mL，制成混合标准品贮备液，置于4℃冰箱中保存备用。混合标准品贮备液中氯化两面针碱、木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱和白屈菜红碱的浓度分别为0.0456mg/mL、0.1933mg/mL、0.1956mg/mL、0.0500mg/mL、0.1472mg/mL。然后从混合标准品贮备液中分别精确量取5、2、1、0.4mL，用70%甲醇定容至10mL，即得不同浓度的混合标准品溶液。3、供试品溶液制备收集12批次的两面针药材作为本研究的供试品（经广西药用植物园黄宝优高级工程师鉴定为两面针Zanthoxylumnitidum(Roxb.)DC.的根），样品信息见表1。表1两面针供试样品信息编号来源采集时间Z1广西苍梧县2019.10Z2广西龙州县2019.10Z3广西兴业县2019.10Z4广西靖西县2019.11Z5广西东兰县2019.11Z6广西巴马县2019.11Z7广西隆安县2019.11Z8广西那坡县2019.12Z9广西环江县2019.12Z10广西武鸣区2019.12Z11广西恭城县2019.12Z12广西平南县2019.12精密称定供试样品粉末（粒径≤0.5mm）1.0g，置于具塞锥形瓶中，加6mL的70%甲醇超声提取30min，重复3次（料液比1:6），合并提取液，用70%甲醇定容至50mL容量瓶中，最后用0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。4、制作标准曲线分别吸取10μL不同浓度的混合标准品溶液依次注入高效液相色谱仪，按“1”项的色谱条件，测定氯化两面针碱、木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱和白屈菜红碱峰面积，以峰面积（As）为纵坐标，对照品浓度（Cs）为横坐标，绘制氯化两面针碱、木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱和白屈菜红碱的标准曲线。结果见表2。5种标准品的高效液相色谱峰图见图1。表2各成分的标准曲线成分回归方程R2线性范围木兰花碱Y=20717X+14.68690.99987.7~193.3橙皮苷Y=11667X+7.62730.99987.8~195.6盐酸血根碱Y=47687X-3.06370.99962.0~50.0氯化两面针碱Y=56676X+1.33790.99971.8~45.6白屈菜红碱Y=74383X+33.05010.99975.9~147.21.木兰花碱；2.橙皮苷；3.盐酸血根碱；4.氯化两面针碱；5.白屈菜红碱。图1对照品高效液相色谱图5、精密度试验精密吸取5种标准品贮备溶液，在“1”项的色谱条件下分别进样5次，测得的木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱峰面积见表3，计算得出5种成分的RSD分别为0.45%、0.21%、0.63%、0.33%、0.29%，表明仪器精密度良好。表3精密度试验峰面积结果分析成分木兰花碱橙皮苷盐酸血根碱氯化两面针碱白屈菜红碱第1次4035.72301.22394.22599.811038第2次4036.62299.52393.82596.111032第3次4045.52294.32384.12586.611004第4次4004.22293.52370.42578.910961第5次4010.22289.32360.12584.110985RSD（%）0.450.210.630.330.296、稳定性试验精密吸取5种标准品贮备溶液，于0、2、4、8、12、24h在“1”项的色谱条件下进样，测得的木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱峰面积见表4，计算得出RSD分别为1.29%、0.98%、1.27%、1.08%、0.83%，表明溶液在24h内稳定性良好。表4稳定性试验峰面积结果分析成分木兰花碱橙皮苷盐酸血根碱氯化两面针碱白屈菜红碱0h4035.72301.22394.22599.8110382h4010.22289.32360.12584.1109854h3982.32284.52389.12576.8110208h3934.32277.22367.42555.71116212h3927.22244.72330.72531.81119324h3906.92250.52320.22534.111183RSD（%）1.290.981.271.080.837、重复性试验精密称取同一批两面针供试品（Z2）粉末6份，分别制备供试品溶液，在“1”项的色谱条件下进样，测得木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱含量见表5，计算得出RSD分别为1.48%、2.24%、1.43%、1.32%、2.36%，表明该方法重复性良好。表5重复性试验含量检测结果分析(mg/g)成分木兰花碱橙皮苷盐酸血根碱氯化两面针碱白屈菜红碱第1份0.13825.4660.018991.0510.4260第2份0.14215.5660.019181.0390.4212第3份0.14405.7150.019501.0540.4384第4份0.13985.8360.019791.0190.4107第5份0.13945.6300.019411.0410.4221第6份0.14075.6630.019461.0260.4349RSD（%）1.482.241.431.322.368、加样回收率试验以供试品（Z2）粉末为材料，制备供试品溶液45份，加入一定浓度的标准品贮备液，然后在“1”项的色谱条件下进样，计算回收率，结果见表6，平均回收率高于97.93%，表明该方法系统误差小。表6加样回收率分析结果成分称样量/g原有量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD木兰花碱0.50080.08910.07140.157197.8699.10.820.50020.08900.07140.158198.540.50040.08910.07140.157297.960.50060.08910.08940.177299.240.50010.08900.08940.177699.520.50070.08910.08940.176999.060.50020.08900.10640.195099.790.50000.08900.10640.195099.810.49990.08900.10640.1955100.08橙皮苷0.50032.83722.2695.2407102.6399.91.430.50012.83612.2695.1739101.350.50052.83832.2695.1399100.640.50072.83952.83625.654599.630.50042.83782.83625.578398.310.50092.84062.83625.568298.090.50122.84233.40346.232199.780.50022.83663.40346.195999.290.50152.84403.40346.231999.75盐酸血根碱0.50160.00850.00680.014997.2197.931.430.50120.00850.00680.015299.210.50090.00850.00680.01597.940.50040.00850.00850.016798.20.50010.00850.00850.01799.990.50060.00850.00850.016798.180.50110.00850.01020.018598.830.50060.00850.01020.01896.20.50090.00850.01020.017995.64氯化两面针碱0.50050.52000.41590.929199.2799.980.790.50080.52030.41590.932499.590.50090.52040.41590.932299.560.50000.51950.51981.027498.850.50020.51970.51981.032899.350.50010.51960.51981.034399.510.50060.52010.62381.1557101.030.50030.51980.62381.1562101.100.50030.51980.62381.1612101.54白屈菜红碱0.50100.22750.1840.408499.2699.721.220.50080.22740.1840.409999.640.50120.22750.1840.409399.450.50080.22740.22820.455499.970.50130.22760.22820.4649102.010.50090.22740.22820.4586100.670.49980.22690.27230.486797.490.50010.22700.27230.498399.790.50020.22710.27230.495299.1610、外标法测定12批次供试样品中5种成分含量分别精密称取12批供试品溶液吸取10μL，在“1”项的色谱条件下进样测定峰面积，根据“表2”的标准曲线计算出浓度，然后计算含量，结果见表7。表7外标法测定得5种成分的含量结果（mg/g）样品氯化两面针碱木兰花碱橙皮苷盐酸血根碱白屈菜红碱Z10.0200.5375.5440.0160.020Z21.0390.1415.6630.0190.426Z30.2360.2984.2330.7340.259Z42.4701.4226.6180.4780.692Z52.8960.8363.9980.5670.129Z63.5211.1195.4720.6571.112Z70.0430.1454.8210.0820.175Z80.7511.7493.2960.1710.474Z90.3510.0342.6920.3380.573Z101.7662.7165.7790.2990.785Z112.1691.0036.8960.8110.944Z123.5781.9436.7820.6110.73411、一测多评法检测供试样品中5种成分含量第一步：氯化两面针碱较易获得，价格低廉，而且在样品中的含量较高，故选择氯化两面针碱为内参，采用外标法检测12批次供试样品中内参的含量，结果见表7中第一列数据。第二步：配制5种标准品的混合液，然后将母液依次稀释成2倍液、5倍液、10倍液和25倍液。第三步：吸取5个浓度的混合标准品溶液各10μL，依次注入高效液相色谱仪，按“1”项的色谱条件，分别测定得出氯化两面针碱、木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱、白屈菜红碱的峰面积As、A1、A2、A3和A4。第四步：根据氯化两面针碱、木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱、白屈菜红碱的浓度Cs、C1、C2、C3和C4，以及响应的峰面积，计算木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱、白屈菜红碱的相对校正因子f1、f2、f3、f4。计算公式如下：f1=(Cs×A1)/（C1×As）;f2=(Cs×A2)/（C2×As）;f3=(Cs×A3)/（C3×As）;f4=(Cs×A4)/（C4×As）。四种成分的相对校正因子计算结果见表8。表8各成分的相对校正因子序号f1木兰花碱f2橙皮苷f3盐酸血根碱f4白屈菜红碱10.3660.2060.8411.31620.3680.2070.8361.31730.3740.2110.8331.33540.3810.2150.8211.35450.3750.2060.8351.351平均值0.3730.2090.8331.335RSD/%1.601.880.891.35第五步：在不同色谱柱下计算相对校正因子，检验重复性。吸取5个浓度的混合标准品溶液各10μL，依次注入高效液相色谱仪，在“1”项的色谱条件下改变色谱柱，分别选择5种不同的色谱柱（ShimadzuWondaCractODS-2、TianheKromasilC18、PhenomenexLunaC18、DalianElitehypersilBDSC18、AgilentZorbaxSB-aqC18），分别测定得出氯化两面针碱、木兰花碱、橙皮苷、盐酸血根碱、白屈菜红碱的峰面积As、A1、A2、A3和A4，计算相对校正因子，结果见表5，可知该方法能满足定量分析要求。表9不同色谱柱测定得出的相对校正因子色谱柱f1木兰花碱f2橙皮苷f3盐酸血根碱f4白屈菜红碱ShimadzuWondaCractODS-20.3820.2020.8211.295TianheKromasilC180.3760.2110.8331.341PhenomenexLunaC180.3870.2150.8241.31DalianElitehypersilBDSC180.3680.2120.8311.274AgilentZorbaxSB-aqC180.3650.2080.8141.284平均值0.3760.2