菌种管理和保藏

菌种的保藏和管理2024/4/111菌种保藏的重要性

菌种保藏是微生物学检验工作中的一项常规技

术，菌种的科学保藏和管理直接关系到检验结

果的正确性。

2024/4/112菌种的来源国内或国外认可的菌种收藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所

有相关特性等效的商业派生菌株。2024/4/113

-广泛收集各种有用的微生物菌种。

-选择最适宜的保藏方法。菌种保藏的中心任务2024/4/114常用菌种保藏方法

菌种保藏的原则根据微生物菌种的生理、生化特性降低微生物细胞的代谢强度。

2024/4/115

标准菌株的复活或培养物的制备应按供应商提供的说明或按验证的方法进行。标准储备菌株-从国内、外菌种收藏机构获得的标准菌株经复活并在适宜的培养基中生长后,既为标准储备菌株。菌种的保藏2024/4/116菌种的保藏抑制微生物的代谢和生长繁殖，如低温、干燥和真空等标准储备菌株经纯度和特性确认后，分装于小瓶中,

可采用低温冷冻干燥，液氮储存，超低温冷冻(低

于-70℃)等方法保存。

2024/4/117菌种的保藏

低于-70℃或低温冷冻干燥可以延长菌种的保存时间.

标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作

菌株。冷冻菌株一旦解冻转种制备工作菌株后,不得重新冷冻

或再次使用。2024/4/118菌种的保藏

工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的商业衍

生物仅可用作工作菌株。2024/4/119菌种的保藏

不同的微生物，应根据其生物特征来选择最适宜的

保藏方法，菌种的保藏方法一般分四个阶段：2024/4/1110⑴

挑选特征典型的纯菌菌落。⑵确定保藏的合适菌体形态，孢子和芽孢死亡代谢作用弱，同时对恶劣环境有很强的抵抗力。⑶选择最适宜的方法。⑷定期对保藏的菌种进行鉴定，确定保藏方法的有效性。菌种的保藏2024/4/1111方法主要原理适用的微生物保藏时间特点液氮超低温保藏法超低温广泛数十年复杂、需要专门设备，有效冷冻真空干燥保藏法干燥、缺氧、低温广泛5～10年以上复杂、需要专门设备和方法，有效干燥（沙土、牛奶）保藏法干燥、无营养产孢微生物1～10年较简便，需制备沙土管，有效液体石蜡保藏法低温、缺氧广泛1年以上简便琼脂斜面低温保藏法低温4℃广泛短时间简便液体冷冻保藏法液体培养基低温广泛半年以上简便一定比例甘油低温、缺氧广泛数十年以上简便瓷珠冷冻保藏法低温广泛1年以上简便菌种的保藏2024/4/1112

琼脂斜面低温保藏法

菌种培养基保存温度传接时间细菌一般为营养琼脂斜面培养基，或根据菌种规定选用培养基4～6℃芽孢菌3～6个月，其他细菌约1个月酵母菌霉菌琼脂或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂斜面培养基4～6℃一般3～6个月真菌PDA琼脂或改良马丁琼脂斜面培养基4～6℃一般3～6个月2024/4/1113

液体冷冻保藏法

菌种保存液（2mL）保存温度保存时间金黄色葡萄球菌营养肉汤1%蛋白胨甘油水

10%～40%甘油-30～-80℃

半年以上或数十年

枯草芽孢杆菌大肠埃希菌胆盐乳糖增菌液乙型副伤寒沙门菌铜绿假单孢杆菌生孢梭菌疱肉培养基白色念珠菌

改良马丁培养基黑曲霉2024/4/1114

液体冷冻保藏法

制备方法1%蛋白胨1.5ml加入甘油0.15ml

,接种新鲜培养物,培养.

保存条件

-80℃可保存数年.

2024/4/1115瓷珠菌种保存

使用方法-用接种环挑取18-24小时新鲜培养物接入冻存液中-拧紧瓶盖，来回颠倒制成均匀的菌悬液-使菌悬液充分吸附在小瓷珠内外表面-将冻存管中的菌悬液吸出-使用时充分摇匀使管内瓷珠分散,取出小瓷珠，可以直接在平板

培养基上划线接种或接种液体培养基,培养。

保存条件

室温保存12个月、-20℃保存12个月、-80℃可保存24个月2024/4/1116二、菌种的传代和使用

工作菌种的传代次数应严格控制，不得超过5代从菌种

保藏中心获得的标准菌株为第0代）防止过度的传代造

成菌种变异。

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细菌的接种、分离和培养

接种：将微生物的培养物、含有微生物或可能污染有微生物的样品接种到培养基上的一种操作技术。2024/4/1118

常用培养基种类

斜面培养基半固体斜面培养基液体斜面培养基平板斜面培养基2024/4/1119接种方法涂布法划线法穿刺法直接加入法等2024/4/1120

分离：为了获得纯菌种（株），采用的将细菌分离成

单个细胞，使其独立分裂繁殖形成单个菌落的

操技术。分离一般采用平板培养基。分离方法主要有分段划线法、连续划线法、

涂布分离法、倾注分离法等。2024/4/1121

接种后的培养基，根据不同微生物生长条件的要求，培养基放在适宜微生物生长的环境中温度、湿度、氧气等），使其生长繁殖的过程。

需气菌培养法

厌氧培养法培养2024/4/1122

培养后微生物的生长判断

固体培养基有菌落生长或沿穿刺线扩散生长。

液体培养基浑浊、菌膜、沉淀等。

2024/4/1123菌种的传代和使用

冻干菌种（0代）↓增菌液培养（1代）↓增菌液培养（2代）→分装冷冻保存↓增菌液培养适宜的斜面培养基→使用工作菌株（3代）↓

工作菌株传代（4代）→冷冻保存↓工作菌株传代（5代）→冷冻保存如使用蛋白胨、甘油水，可取各代的斜面培养物，加入培养基中，在规定条件培养后冷冻保存。2024/4/1124

斜面培养物↓稀释（比浊或预实验）↓菌液稀释↓平板计数↓验证实验、阳性对照

平板计数也可和试验同时进行

菌液的制备和使用2024/4/1125

三、菌种的检查与复壮

菌种的衰退菌种经过长期人工传代培养或保藏，由自发突变的作用

而引起某些优良特性变弱或消失的现象。控制菌种的衰退方法

控制传代次数

创造适宜的培养条件采用有效的保藏方法2024/4/1126

定期检查

定期检查复活、分离、纯化、检查鉴定和再保藏。发现变异或衰退，应及时给予恢复。

主要检查项目菌落形态、革兰染色、显微镜下菌体形态、生化特性及血清学检查。菌种的检查与复壮2024/4/1127菌种的复壮

主要采用分离纯化的方法。经过形态特征、生理生化特征、代谢产物、血清学等一系列实验鉴定，证明复壮后的菌种与原种完全一致，方可认为菌种已被复壮。菌种的检查与复壮2024/4/1128

四、菌种的管理

使用菌种的单位，应具备从事微生物工作的条件和设备。菌种应由专人负责管理，管理人员应具有微生物专业知

识和技术水平，并应具有较强的责任心。

2024/4/1129菌种的管理

实验室必须建立菌种保存和使用文件化的程序管理制度；

包括：每支菌种标注名称、标准号、接种日期、传代次数、进出、收集、贮藏、保存、确认试验以及销毁的记录、标准菌种的申购记录、从标准菌株到工作菌株操作记录，如菌种定期转种传代，鉴定（纯度、特性）、培养基和培养条件、菌种保存的位置和条件及其它需要的程序。2024/4/1130菌种应冷藏或冷冻保存，保存菌种的冰箱不得放置食品和易挥发性药品，放置菌种应有专用的冰箱，应上锁管理。由专人按操作规程和有关要求定期进行传代，并定期对保存的菌种进行检查，一般每年1～2次，（或定期更换冻干菌种）。发现菌种的异常情况应及时检查。一旦发现菌种污染和变异现象，应立即报告、研究处理。尤其长期保存时。

菌种的管理2024/4/1131

详细记录菌种的来源、接收、传代、分离、复壮、使用和鉴定等均应做好详细记录。包括菌保存位置、环境(温度)、种传代或使用时间、名称、菌号、代数、传代或保存形式、分离、复壮方式、使用内容、鉴定情况等都应进行详细的记录。2024/4/1132菌种不得随意带出实验室，外单位索取、购买应有证明和登记，并包装严密。菌种处理应严格按操作规程进行，灭菌处理应有详细记录。

2024/4/1133菌悬液的制备与保存

采用经验证的方法制备菌悬液，除另有规定外，微生物限度试验用菌悬液的制备如下：

1、接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18～24小时.2、接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu的菌悬液。2024/4/11343、接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基

中，培养5～7天。加入3～5ml含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化

钠溶液，将孢