细胞生物学件

关于细胞生物学件第一节细胞形态结构的观察方法一、光镜技术

1、几种常见光学显微镜

A普通光学显微镜

普通生物显微镜由3部分构成，即：①照明系统，包括光源和聚光器；②光学放大系统，由物镜和目镜组成，是显微镜的主体；③机械装置，用于固定材料和观察方便。第2页,共54页，2024年2月25日，星期天第3页,共54页，2024年2月25日，星期天B暗视野显微镜

使用特殊的照明方法，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至

4~200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。

应用：观察未经染色的活体或胶体粒子。第4页,共54页，2024年2月25日，星期天第5页,共54页，2024年2月25日，星期天

C相差显微镜（PCM）

1953年获得诺贝尔物理奖，相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光（直射光和衍射光）的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。

应用：观察未经染色的标本和活细胞。一种介壳虫的染色体（PCM照片）第6页,共54页，2024年2月25日，星期天在相差显微镜下观察的分裂期细胞变化过程

第7页,共54页，2024年2月25日，星期天

D倒置显微镜组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。第8页,共54页，2024年2月25日，星期天E荧光显微镜

细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。第9页,共54页，2024年2月25日，星期天第10页,共54页，2024年2月25日，星期天荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）第11页,共54页，2024年2月25日，星期天F微分干涉差显微镜（DIC显微镜）

能显示细胞结构的三维立体投影影像，立体感强，用于研究活细胞中较大的细胞器，与录像设备结合，可观察活细胞中的颗粒及细胞器的运动。尼康E800荧光DIC显微镜第12页,共54页，2024年2月25日，星期天DIC显微镜下的硅藻第13页,共54页，2024年2月25日，星期天

G激光共聚焦扫描显微镜（LSC显微镜）

可改变观察的焦平面，因而能进行“光学切片”，观察较厚样品的内部结构。将改变焦点获得的一系列细胞不同平面上的图像叠加后，可重构出样品的三维结构。

激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。第14页,共54页，2024年2月25日，星期天第15页,共54页，2024年2月25日，星期天LCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管第16页,共54页，2024年2月25日，星期天2光镜标本的制备以石蜡切片为例：材料处理固定脱水包埋切片染色观察

染色剂：普通染色剂，荧光染色剂第17页,共54页，2024年2月25日，星期天3光镜技术的应用

A观察活细胞的形态结构，生命运动，细胞周期。

B细胞器的定位及功能研究。

C基因产物与大分子物质的定位及定量。

D监测细胞代谢活动。

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例：胞内钙离子浓度的监测钙是通用的第三信使，能特异地选择性地调节细胞的活动，因此测定细胞中钙离子浓度在空间和时间上的变化，对于监控许多细胞的生理活动有重要作用。如受精时，卵细胞突然定位地将钙离子释放到胞浆中。

钙指示剂：FuRA－2，水母发光蛋白等第19页,共54页，2024年2月25日，星期天沙元双细胞胚中一个细胞的钙信号引起钙依赖水母发光蛋白发光第20页,共54页，2024年2月25日，星期天罗丹明123染色后显示的细胞线粒体的定位第21页,共54页，2024年2月25日，星期天二、电镜技术1、透射电子显微镜（TEM）

透射电子显微镜以电子束为光源，由于电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短，因而使其分辨力大大提高，目前TEM的分辨力可达0.2nm。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。第22页,共54页，2024年2月25日，星期天第23页,共54页，2024年2月25日，星期天第24页,共54页，2024年2月25日，星期天

2扫描电子显微镜（SEM）扫描电子显微镜（SEM），可用来观察标本的表面结构。其工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。第25页,共54页，2024年2月25日，星期天第26页,共54页，2024年2月25日，星期天人类红细胞的SEM图片第27页,共54页，2024年2月25日，星期天花粉的SEM图片昆虫卵的SEM图片第28页,共54页，2024年2月25日，星期天3扫描透射电子显微镜（STEM）

是唯一不需要染色、固定而能够直接观测单个生物分子的仪器。世界上仅有几台。

4扫描隧道显微镜（STM）

获1986年诺贝尔物理学奖。可用来显示晶体表面原子布阵。固态、液态和气态三态物质均可进行观察，能直接观察生物大分子的原子布阵，也能观察一些生物结构的原子排列，有助于把生物学研究推进到纳米科学水平。第29页,共54页，2024年2月25日，星期天第二节细胞组分的分析方法

一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物

1、差速离心

2、密度梯度离心

1）速度沉降主要用于分离密度相近而大小不一的细胞组分。

2）等密度沉降主要用于分离不同密度的细胞组分。第30页,共54页，2024年2月25日，星期天

在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器

,速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀第31页,共54页，2024年2月25日，星期天A：速度沉降B：等密度沉降第32页,共54页，2024年2月25日，星期天

二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些 特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布与含量。第33页,共54页，2024年2月25日，星期天Feulgen反应→DNA

苏丹Ⅲ→脂类第34页,共54页，2024年2月25日，星期天

酶的显示是通过显示酶的活性来表明酶的存在，而不是酶的本身。将具有酶活性的组织放入含有一定底物的溶液中孵育，底物经酶的作用形成初级反应产物，它再与某种捕捉剂相反应,形成显微镜下可视性沉淀,即最终反应产物。

如：细胞内酸性磷酸酶的显示先将切片放入含有酶底物(常用β-甘油磷酸钠)的溶液中孵育，底物经酶的作用，水解并释放出磷酸；用捕捉剂硝酸铅与磷酸反应，形成微细的磷酸铅沉淀，此时，可在电镜下检出；如再用硫化铵处理时，磷酸铅被置换成硫化铅沉淀，可在光镜下见到。第35页,共54页，2024年2月25日，星期天

ABA:细胞色素氧化酶活性定位B:ATP酶活性定位第36页,共54页，2024年2月25日，星期天

三、特异蛋白抗原的定位与定性

一般说来，发生在组织细胞内的抗原抗体反应是不可见的，但如果事先将某种荧光素、酶、同位素等用生化方法标记在抗体分子上（标记抗体），就能凭借特殊光镜及电镜等观察标本中的荧光现象、酶作用的沉淀物（颜色）、放射线径迹的有无和部位，由此判断是否发生了特异性的抗原抗体反应以及抗原物质的定位分布。第37页,共54页，2024年2月25日，星期天四、细胞内特异核酸的定位与定性原位杂交：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法。在显微与亚显微水平上的基因定位、特异mRNA表达等研究中起重要作用。光镜水平的原位杂交技术

（同位素标记或荧光素标记探针）

电镜水平的原位杂交技术（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）第38页,共54页，2024年2月25日，星期天

人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片第39页,共54页，2024年2月25日，星期天五、放射自显影技术原理及应用：

利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与定量研究；

实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。第40页,共54页，2024年2月25日，星期天a：疏松染色质处的RNA转录

b：骨髓细胞高尔基复合体处的硫酸酯（箭头处）第41页,共54页，2024年2月25日，星期天六、定量细胞化学分析技术

细胞显微分光光度术

利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质如（核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。

第42页,共54页，2024年2月25日，星期天

流式细胞术：

指用流式细胞仪（FCM）对细胞或染色体进行分选或对单个细胞或其它生物微粒进行定量分析的一门技术。

主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量； 测定细胞群体中不同时相细胞的数量； 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞； 分离特异染色的染色体。第43页,共54页，2024年2月25日，星期天※细胞分选荧光标记抗体探针＋细胞抗原细胞被标记除去游离抗体稀释超声波振荡器内与鞘液混合液滴被激普通细胞：干涉检测器检测光激发荧光标记：干涉检测器＋细胞荧光检测器检测鞘液带上正电荷负极收集器鞘液带上负电荷正极收集器※染色体分选同理。用荧光标记的DNA探针同特异染色体结合，使待分选的染色体带上荧光标记。第44页,共54页，2024年2月25日，星期天用流式细胞计分选细胞示意图第45页,共54页，2024年2月25日，星期天第三节细胞培养、细胞工程

与显微操作技术

一、细胞培养二、细胞工程三、显微操作技术第46页,共54页，2024年2月25日，星期天

高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难