（高清版）GBT 43282.2-2023 塑料 暴露于海水中塑料材料需氧生物分解的测定 第2部分：采用测定密闭呼吸计内需氧量的方法

塑料暴露于海水中塑料材料需氧生物分解的测定第2部分：采用测定密闭呼吸计内需氧量的方法2023-11-27发布GB/T43282.2—2023/ISO23977-2:2020 12规范性引用文件 l3术语和定义 14原理 35试验环境 3 37仪器设备 48步骤 48.1试验材料 48.2参比材料 58.3试验容器 58.4前处理 58.5开始试验 68.6结束试验 69结果的计算和表达 69.1计算 69.2外观检验 79.3结果表达与解释 710结果的有效性 711试验报告 7附录A(资料性)基于压力测量的呼吸测量系统示例 9参考文献 IⅢ本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件是GB/T43282《塑料暴露于海水中塑料材料需氧生物分解的测定》的第2部分。GB/T43282已经发布了以下部分：——第1部分：采用分析释放二氧化碳的方法；——第2部分：采用测定密闭呼吸计内需氧量的方法。本文件等同采用ISO23977-2:2020《塑料暴露于海水中塑料材料需氧生物分解的测定第2部请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国生物基材料及降解制品标准化技术委员会(SAC/TC380)提出并归口。本文件起草单位：北京工商大学、安徽丰原生物技术股份有限公司、深圳市正旺环保新材料有限公司、宁波家联科技股份有限公司、山西华阳生物降解新材料有限责任公司、合肥恒鑫生活科技股份有限公司、扬州惠通科技股份有限公司、浙江海正生物材料股份有限公司、重庆市联发塑料科技股份有限公有限公司、深圳万达杰环保新材料股份有限公司、安徽华驰环保科技有限公司、惠通北工生物科技(北华道可降解材料技术有限公司、营口正大实业有限公司、轻工业塑料加工应用研究所。众所周知，海洋垃圾会对海洋生物和人类造成危害和负面影响。暴露在海洋环境中的退化程度是影响塑料材料冲击性能和强度的因素之一。不能认为这些制品可生物降解，而随意地丢弃在环境中，这是不可取的，这些制品也需要回收和再利用。然而，自然环境(例如，土壤或海洋环境)塑料的生物降解程度和速率测定试验方法是值得关注的，以便更好地描述这些特定环境中塑料的降解行为。因此，生物降解程度和速率对于揭示塑料材料在不同海洋环境下的潜在生物降解性具有重要意义。GB/T43282《塑料暴露于海水中塑料材料需氧生物分解的测定》拟由两个部分构成。 第1部分：采用分析释放二氧化碳的方法。目的在于用测量二氧化碳释放量的方法确定塑料材料需氧生物分解程度和速率。——第2部分：采用测定密闭呼吸计内需氧量的方法。目的在于用测量需氧量的方法确定塑料材料需氧生物分解程度和速率。两部分内容均描述了确定塑料材料需氧生物分解程度和速率的实验室测试方法。但塑料材料的生物分解分别通过在实验室条件下测量密闭式呼吸计中塑料材料暴露于从沿海地区采集的海水中的二氧化碳释放量和需氧量来确定。目前已建立了几种在不同环境和实验室条件下塑料材料的生物降解试验方法，如表1所示。表1塑料生物降解试验方法条件试验方法环境需氧/厌氧受控堆肥条件需氧条件GB/T19277.1—2011GB/T19277.2—2013高固体厌氧堆肥条件厌氧条件GB/T33797—2017受控污泥消化系统厌氧条件GB/T38737—2020土壤需氧条件GB/T22047—2008水性培养液需氧条件GB/T19276.1—2003GB/T19276.2—2003厌氧条件GB/T32106—2015海水/沙质沉积物界面需氧条件GB/T40611—2021*GB/T40612—2021海洋沉积物需氧条件GB/T40367—2021*海水需氧条件GB/T43282.1—2023本文件*暴露于海洋微生物的塑料材料生物降解能力测定试验方法。所有海洋生物降解测试方法都基于塑料材料与取自海岸线地区的海洋样本(海水和/或沉积物)的接触情况。从定量的观点来看，这些方法是不相等的，例如，海水中的微生物密度通常比沉积物中的密V中的营养物浓度高。本文件提供了一种在实验室条件下测定暴露于中上层海水中微生物群的塑料材料的生物分解水平的测试方法。生物分解率由测量二氧化碳释放量得到。该测试方法既能用海水进行(“远洋海水试远洋海水试验模拟的是在低水流和低潮汐运动的近海地区条件，而悬浮沉积物海水试验模拟的是在强水流和潮汐运动的沿海地区的可能条件。1GB/T43282.2—2023/ISO23977-2:2020塑料暴露于海水中塑料材料需氧生物分解的测定第2部分：采用测定密闭呼吸计内需氧量的方法本文件描述了确定塑料材料需氧生物分解程度和速率的实验室测试方法。塑料材料的生物分解是通过在实验室条件下，测量密闭式呼吸计中塑料材料暴露于从沿海地区采集的海水中的需氧量来确定的。本文件描述的条件可能与发生最大程度生物分解的最佳条件不一致。然而，本测试方法旨在指示塑料材料的潜在生物分解性。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于ISO5667-3水质取样第3部分：水样的保存和处理(Waterquality—Sampling—Part3:Pre-aervationandhandlingofwatersamples)ISO8245水质总有机碳量(TOC)和溶解性有机碳量(DOC)的测定指南[Waterquality—Guidelinesforthedeterminationoftotalorganiccarbon(TOC)anddissolvedorganiccarbon(DOC)]ISO10210塑料材料生物分解试验用样品制备方法(Plastics—Methodsforthepreparationofsamplesforbiodegradationtestingofplasticmaterials)ISO10523水质pH的测定(Waterquality—DeterminationofpH)ISO11261土壤质量总氮量测定改进的凯氏定氮法(Soilquality—Determinationoftotalni-trogen—ModifiedKjeldahlmethod)3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。远洋带pelagiczone海底上方的水体。2GB/T43282.2—2023/ISO23977-2:2020生化需氧量biochemicaloxygendemand;BOD在特定条件下，化合物或有机物在水中由于需氧生物氧化作用所消耗的溶解氧的质量浓度。注：以每毫克(mg)或克(g)化合物吸收氧气的毫克数表示。理论需氧量theoreticaloxygendemand;ThOD将化合物完全氧化所需氧气的理论最大值，可由分子式计算得到。注：以每毫克或每克试验材料吸收氧气的毫克数表示(mgO₂/mg试验材料或mgO₂/g试验材料)。总有机碳totalorganiccarbon;TOC溶解或悬浮在水中的有机物所含有的碳含量。注：表示为每100mg化合物中碳的毫克数。溶解有机碳totalorganiccarbon;DOC溶解在水中、无法以特别相分离方法(如40000m/s离心分离15min或孔径0.2μm～0.45μm过滤膜过滤)而分离的有机碳。迟滞阶段lagphase从试验开始一直到微生物适应和(或)选定了分解物，并且试验材料的生物分解程度已经增加至最大生物分解率(3.8)10%时所需要的天数。从迟滞阶段(3.6)结束至平稳阶段所需的时间。注：以天为单位。试验中，试验材料不再发生生物分解时的生物分解程度，以百分率(%)表示。平稳阶段plateauphase从生物分解阶段(3.7)结束至试验结束时所需的天数。前处理pre-conditioning在没有试验材料存在的情况下，对培养液预培养，目的是使微生物适应试验条件以提高试验效果。34原理本文件描述了使用静态水测试系统测定天然海水中本地微生物种群对塑料材料生物分解性测试方法的两种变化。该测试在中温测试条件下进行海水试验”)或加入少量沉积物的海水(“悬浮沉积物海水试验”)一起孵育，这些沉积物来自海水取样的该测试系统在密闭容器呼吸计中。在烧瓶的顶部空间设置合适的吸收器以吸收释放的二氧化碳。生化需氧量(BOD),通过测量呼吸计中维持气体体积恒定的需氧量，或通过自动或人工测量体积或压力(或两者的组合)的变化来确定。通过生化需氧量(BOD)与理论需氧量(ThOD)的比值得到材料的生物分解率(以百分率表示)。宜将硝化过程可能对BOD的影响纳入考量。试验结果为生物分解率的最大量，由生物分解曲线的平稳5试验环境培养应在黑暗或漫射光的密闭空间中进行，该空间应没有抑制微生物生长繁殖的气氛，并保持恒温。温度宜在15℃~25℃之间，但不超过28℃,精确至±1℃。任何温度变化都应在试验报告中予以解释说明。注：测试温度可能不同于海洋环境的实际温度。6试剂只使用公认的分析级试剂。蒸馏水或去离子水，不应含有毒物质(尤其是铜),TOC含量小于2mg/L。6.2天然海水/沉积物使用前，用适当的方法去除海水中的粗颗粒，如沉积物适用，去除其中粗颗粒。报告中应记录处理海水能用纸过滤器过滤，以去除粗颗粒。宜至少使用没有粗颗粒的过滤海水洗涤至少两次来减少沉积物中粗颗粒的数量。按照ISO8245、ISO10523和ISO11261分别测量海水(如适用)和沉积物样品的TOC、pH和氮若发现海水样品的TOC含量偏高，则宜在使用前对海水进行大约一周的前处理。例如，如果加入试验样品后，TOC的背景浓度超过总TOC的20%左右，则可在试验温度、黑暗或漫反射光条件下，并在需氧条件下通过搅拌对海水和沉积物进行前处理，以减少易降解有机物的含量。提供以下有关海水的资料，以及沉积物样本(如适用)的资料：4——收集深度(m);——采集时温度(℃);——盐度(PSU);——总有机碳(TOC,mg/L);——预处理过程的描述(如适用)。确保所有的玻璃器皿都经过彻底清洁，特别是不含有机或有毒物质。所用为实验室常规设备及如7.1密闭呼吸计宜选用容量为300mL的生物量瓶。容器应置于恒温室或恒温装置(如水浴)中。在不影响试验条件的情况下，能使用容量更大或更小的反应器。合适的仪器见附录A中图A.1。任何能足够准确地确定生化需氧量的呼吸器都是合适的，最好是能自动和连续地测量和替换所消耗的氧气的装置，这样在降解过程中就不会出现氧气不足和微生物活动的抑制。ISO8245规定了用于测量总有机碳(TOC)和溶解有机碳(DOC)的分析设备。7.2硝酸盐和亚硝酸盐浓度分析设备宜首先进行定性试验，以确定是否发生了硝化作用。如果介质中有硝酸盐/亚硝酸盐，则需要使用合适的方法(如离子色谱)进行定量。灵敏度至少应为0.1mg。7.4磁力搅拌器样品应具有已知质量，并含有足量的碳，能产生足够通过系统测量的BOD[密闭呼吸计(7.1)]。采用试验材料浓度为每升海水和沉积物中至少100mg。样品质量对应ThOD约170mg/L或TOC约60mg/L。每个烧瓶的最大样品质量受限于瓶中氧气供应。应计算ThOD(见ISO14851:2019的附录A)和TOC(按照ISO8245或由化学式或元素分析)。将试验材料以粉末或薄膜的形式添加至试验烧瓶中。如果采用粉末状试验材料，应使用已知的、尺5寸分布较窄的颗粒。宜采用最大直径为250μm的颗粒。粉末的制备应按照ISO10210规定进行。如1.0cm,长度：取决于聚合物的质量和薄膜的厚度)。宜将其固定在如聚四氟乙烯(PTFE)涂层纤维网(尺寸：约4cm×9cm,孔尺寸：5mm×5mm)。纤维网被折叠成两层(约2cm×9cm),在中间固定各种试验材料。然后将纤维网的两端黏接在一起。固定在纤维网之间的试验材料以圆筒的形式直立放置在瓶子底部(见图A.2)。试验材料的形态和形状会影响其生物分解性。试验中宜使用颗粒尺寸相近的粉末。如需要对比不同种类的塑料材料，宜采用相似形状和厚度的样品。当试验中使用粉末或薄膜时，颗粒或薄膜能黏附在海水上方的烧瓶内壁上。这种情况，宜轻轻摇晃瓶子，将粉末或薄膜片冲回海水试样中。如果材料以固定在如聚四氟乙烯(PTFE)涂层纤维网(见图A.2)中间的塑料材料加入，则大部分时间都浸在海水中。使用微晶纤维素或无灰纤维素滤纸作为参比材料。如可能，其TOC、形态和尺寸宜与试验材料的使用与试验材料相同形态的非生物分解聚合物(如聚乙烯)作为负控制参比材料。a)3个盛装试验材料的烧瓶(符号Fr);b)3个用于空白试验的烧瓶(符号F);c)3个盛装参比材料的烧瓶(符号Fc);此外，如果预计降解过程超过6个月，推荐设置负控制参比：d)3个盛装负控制参比材料(符号Fy)。如为了筛选，可用2个烧瓶盛装试验材料、空白、参比材料和负控制参比材料，而不是3个烧瓶。规定使用容积为300mL的试验瓶。该试验是分批进行的，方法是将试验材料与90mL天然海水单独孵育(“远洋海水试验”),或与90mL添加了0.1g/L～1.0g/L(湿重)沉积物的天然海水孵育(“悬浮沉积物海水试验”)。在试验烧瓶的吸收室中加入二氧化碳吸收剂(见ISO14851:2019的附录C)。将密封的烧瓶放在恒温环境中的磁力搅拌器(7.4)上，并使所有容器达到所需的温度。搅拌应持续进行(如100r/min搅拌),以保持微生物和沉积物(如适用)处在悬浮状态。沿海地区泥沙的磨蚀是由水流和潮汐运动引起的自然现象。然而，如果使用磁力搅拌子来混合添加了沉积物的海水(“悬浮沉积物海水试验”),宜使用PTFE涂层的哑铃状磁力搅拌子，或者使用配备了支点环的PTFE涂层磁力搅拌子，以减少试验期间沉积物的过度磨损。其他搅拌系统也能使用，例如参考文献[17]和OECD308:2002附录4所采用的装置。在压力计上进行读数(如果是手动的),验证氧气消耗记录仪工作正常(自动呼吸计)。进行这一阶段是为了验证不同容器中的内源性呼吸是相似的。此外，根据6.2中给出的前处理程序，天然海水中和沉积物中(如适用)的易降解有机材料背景浓度在这一阶段降低。6GB/T43282.2—2023/ISO23977-2:20208.5开始试验前处理结束后，打开烧瓶，并将试验材料以粉末或薄膜的形式加入试验烧瓶中。依据8.1中规定的初始试验样品浓度，使用容积为300mL的烧瓶时，样品的质量应约为20mg试验材料。对参比材料和负控制参比材料(如适用)重复上述操作。记录加入每个烧瓶的试验样品质量、海水体积和沉积物质量(如适用)。宜在试验开始时，在海水样品中加入KH₂PO₄(0.1g/L)和NH₁Cl(0.05g/L)。依据ISO10523测量海水的pH,如有必要，使用盐酸(HCl)或氢氧化钠(NaOH)溶液将pH调整至在试验期间，可根据需要补充营养素，以支持微生物多样性和维持试验材料的生物分解能力。注意试验材料、参比材料和负控制参比材料(如适用)中的碳与培养基中氮的比例至少为C:N=40:1。如此外，如果预计测试材料在显著的生物分解之前有很长的滞后期，则能定期用新鲜海水和沉积物替换部分海水(如约20%)和沉淀物(如适用，如约20%),以减少必要营养物质的可能损耗并维持微生物群落的多样性。如果更换海水和沉积物(如适用),则所有试验材料、参考材料和空白烧瓶中都应更换。在更换海水过程中，应采取适当措施，确保测试材料仍留在试验烧瓶中。能用移液管小心地吸取海水来更换试验烧瓶中的海水，并目测试验材料没有被移除。能使用镊子更换沉积物。宜在迟滞阶段结束后生物分解阶段开始的时候，停止海水和沉积物的更换。通过观察参考物质生物分解曲线的时间进程，可判断是否需要补充营养物质或采取其他适当措施。任何营养素的添加和处理方法都应在检测报告中予以说明。8.6结束试验当BOD达到恒定(平稳阶段),并且预期没有进一步的生物分解时，则认为试验完成。试验周期不宜超过1年。然而，如果仍能观察到显著的生物分解，并且在这段时间后还没有达到平台期，则可延长试验，但不超过2年。在测试时间较长的情况下，应特别注意技术系统(如测试容器和连接的密封性)。采取任何特殊措施，例如确保微生物多样性(见8.5)或提供足够的营养物质(见8.5),均应在试验报告中详细说明。试验结束时，立即测量所有烧瓶中海水的pH、硝酸盐和亚硝酸盐的浓度，或取适当样品保存。使用这些数值校正硝化生物分解率计算值(见ISO14851:2019的附录B)。9结果的计算和表达使用适当呼吸计，根据使用方法，读取每个烧瓶的耗氧量。按公式(1)计算试验材料实际的生化需氧量(BODg),即试验烧瓶Fr耗氧量减去空白F耗氧量再除以试验材料浓度： (1)式中：BODs——实际BOD,单位为毫克每毫克(mg/mg);BOD,——在t时刻含有试验材料的烧瓶Fr的BOD,单位为毫克每升(mg/L);BOD——在t时刻空白烧瓶的BOD,单位为毫克每升(mg/L);pre——在烧杯Fr反应混合物中试验材料的浓度，单位为毫克每升(mg/L)。按公式(2)计算生物分解百分率D.,即特定生化需氧量与理论需氧量(ThOD,mg/g试验材料)之比：7GB/T43282.2—2023/ISO23977-2:2020式中：…………D₁——生物分解百分率，%;BODs——实际BOD,单位为毫克每毫克(mg/mg);ThOD——理论需氧量，单位为毫克每克(mg/g)。以同样的方法计算参比材料Fc的BOD和生物分解百分率，以及负控制参比Fx(若有)的BOD和生物分解百分率。氧气(见ISO14851:2019的附录B)。9.2外观检验在测试结束时，检查样品的状况。如果样品仍然存在，则回收样品能进行质量测定、其他分析和拍照。9.3结果表达与解释为每个测量间隔和每个试验瓶测得的BOD值、生物分解百分率制定表格。对于每个试验烧瓶，以时间为横坐标，绘制BOD曲线以及生物分解百分率曲线。可对平均生物分解百分率绘制曲线。生物分解率最大值由生物分解曲线平稳阶段的平均值或最高值求得，如当曲线开始下降或在平稳阶段缓慢增加时，表示试验材料的生物分解程度。试验材料的吸湿性和形状可能会对试验结果产生影响，因此试验可选用化学结构类似的试验材料进行比较。当试验结果显示较低生物分解率时，试验材料的毒性资料可有助于结果的解释。10结果的有效性试验只有符合下列条件时，结果才被认为有效：的生物分解率大于60%;b)试验结束时空白F。的BOD不超过上限值；40mg/L～80mg/L。c)3个空白F的BOD应在平稳阶段或试验结束时BOD平均值的20%以内；d)试验结束时，不同容器中参比材料(Fc)的生物分解百分比的相对偏差应小于20%;e)测试结束时，负控制参比(烧瓶Fy)的生物分解率低于10%。如果不能满足以上条件，请使用其他天然海水重新试验。11试验报告试验报告应包含下列内容：a)本文件编号；b)所有关于试验材料、参比材料的必要信息，如TOC、ThOD和化学成分、配方(如已知)、状形态和数量；8c)所用海水、海洋沉积物(如适用)的来源(见6.2);d)前处理阶段的描述，如适用(见8.4);e)该试验作为远洋海水试验(不添加沉积物)或作为悬浮沉积物海水试验(添加沉积物)进行；h)采用的分析技术，包括呼吸计、TOC以及硝酸盐/亚硝酸盐测定的原理；i)试验材料和参比材料的全部试验结果(以表格和图片的形式),包括BOD和生物分解百分率值，这些参数随时间的变化曲线及硝酸盐/亚硝酸盐浓度；j)迟滞阶段、生物分解阶段所用时间、达到最大生物分解率和整个试验所用时间；以及负控制参比Fx(如有);k)任何其他相关数据(如样品仍有残留，最终样品分析及最终样品照片);1)为了确保生物多样性或避免营养缺乏，试验期间采用方法的详细信息(见8.5);m)任何与本文件规定的试验条件有偏差的内容。9(资料性)基于压力测量的呼吸测量系统示例生化需氧量(BOD)呼吸计基于封闭系统中的压力测定。容器中的微生物消耗O₂并生成CO₂。释放的CO₂被CO₂吸收剂(通常为NaOH)吸收，产生的真空能被直接读取为BOD的测量值(mg/L)。通常情况下，呼吸测量系统如图A.1所示，使用容积为300mL的烧瓶装入约90mL来自远洋区域的海水，如果适用，加入沉积物(湿重，0.1g标引序号说明：1——带有红外接口的压力测量头；2——用于CO₂吸收的吸收器；3——顶空；4——海水；5——磁力搅拌子；6——带有红外接口的控制器；7——pH电极(可选带有pH测量)。图A.1呼吸测量系统示例图A.2呼吸测量系统中固定在聚四氟乙烯(PTFE)涂层纤维网之间的塑料条暴露在海水中的示例GB/T43282.2—2023/ISO23977-2:2020[1]GB/T19276.1—2003水性培养液中材料最终需氧生物分解能力的测定采用测定密闭呼吸计中需氧量的方法(ISO14851:1999,IDT)[2]GB/T19276.2—2003水性培养液中材料最终需氧生物分解能力的测定采用测定释放的二氧化碳的方法(ISO14852:1999,IDT)[3]GB/T19277.1—2011受控堆肥条件下材料最终需氧生物分解能力的测定采用测定释放的二氧化碳的方法第1部分：通用方法(ISO14855-1:2005,IDT)[4]GB/T19277.2—2013受控堆肥条件下材料最终需氧生物分解能力的测定采用测定释放的二氧化碳的方法第2部分：用重量分析法测定实验室条件下二氧化碳的释放量(ISO14855-2:2007,IDT)[5]GB/T22047—2008土壤中塑料材料最终需氧生物分解能力的测定采用测定密闭呼吸计中需氧量或测定释放的二氧化碳的方法(ISO17556:2003,IDT)[6]GB/T32106—2015塑料在水性培养液中最终厌氧生物分解能力的测定通过测量生物气体产物的方法(ISO14853:2005,IDT)[7]GB/T33797—2017塑料在高固体份堆肥条件下最终厌氧生物分解能力的测定采用分析测定释放生物气体的方法(ISO15985:2014,IDT)[8]GB/T38737—2020塑料受控污泥消化系统中材料最终厌氧生物分解率测定采用测量释放生物气体的方法(ISO13975:2019,IDT)[9]GB/T40367—2021塑料暴露于海洋沉积物中非漂浮材料最终需氧生物分解能力的测定通过分析释放的二氧化碳的方法(ISO22404:2019,IDT)[10]GB/T40611—2021塑料海水沙质沉积物界面非漂浮塑料材料最终需氧生物分解能力的测定通过测定密闭呼吸计内耗氧量的方法(ISO18830:2016,IDT)[11]GB/T40612—2021塑料海水沙质沉积物界面非漂浮塑料材料最终需氧生物分解能力的测定通过测定释放二氧化碳的方法(ISO19679:2020,IDT)[12]GB/T43282.1—2023塑料暴露于海水中塑料材料需氧生物分解的测定第1部分：采用分析释放二氧化碳的方法(ISO23977-1:2020,IDT)[13]ISO14851:2019Determinationoftheultimateaerobicbiodegradabilityofplasticmateri-alsinanaqueousmedium—Methodbymeasuringtheoxygendemandinaclosedrespirometer[14]ISO22766:2020Plastics—Determin