核酸检测实验室建立与应用

关于核酸检测实验室建立与应用15.04.20242核酸扩增检测实验室的建立人员场地检测方法选择实施方案依据：卫生部颁发的《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号）第2页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.20243核酸实验室人员要求资质:经过临检中心PCR培训班培训并取得上岗证；通过血站核酸实验室岗前培训考试合格。培训:①无”核酸”的概念形成,②防污染的概念③良好工作习惯的培养.④报告的正确发放.后备人员的培养.第3页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.20244试剂准备区标本制备区扩增区及扩增产物分析区样本离心交接区报告发放区核酸实验场地第4页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.20245

方法选择:TMA与PCRTMAPCR扩增原理模拟自然DNA转录成mRNA的过程模拟自然DNA复制的过程靶目标RNADNA酶MMLV逆转录酶及T7RNA聚合酶DNA聚合酶反应体系两种酶，两条引物，dNTP,NTP一种酶，一对引物，dNTP温度条件恒温（41.5℃）循环导热（变性，退火，延伸）扩增仪器水浴箱或者加热块热循环仪扩增产物RNADNA扩增速度每个循环可以生成100-1000个复制物，在15-30分钟内可增加10亿倍复制物以2n扩增，2～3h就能将待扩目的基因扩增放大10亿倍第5页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.20246TMA的优点缺点自动化程度高灵敏度高扩增效率高：10n

不能绝对定量第6页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.20247PCR的优点缺点易于自动化灵敏度高

扩增效率高汇集拆分过程繁琐

拆分可减低非反应性比率第7页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.20248核酸试剂质控试剂的确认试剂运输过程的控制(温度\条件\时限)

灵敏度的要求内标的要求试剂涵盖的基因型

第8页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.20249检测流程(1):常规筛查合格汇集标本检测流程第9页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202410检测流程(2):常规筛查合格单人份标本检测流程第10页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202411检测流程(3):平行检测流程样本清点交接核酸单份检测常规检测合格标本不合格标本阴性标本反应性标本合格标本发布结果单项目反应性无反应性

阳性或可疑结果淘汰

阳性或可疑结果淘汰第11页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202412标准操作规程(SOP)的编写核酸实验室设置与管理规范核酸实验室标本检测流程核酸实验室岗位职责核酸实验室关键试剂管理规范核酸实验室仪器设备管理规范核酸实验室检测标本管理规范核酸实验室室间质量评价规范核酸实验室记录管理制度核酸实验室生物防护规范核酸反应性献血者追踪规程核酸实验室检测应急措施第12页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202413标准操作规程(SOP)的编写核酸标本离心交接操作规程核酸标本提取及汇集操作规程(科华)核酸标本扩增检测操作规程（科华）核酸标本全自动检测分析系统操作规程（CHIRON）核酸标本检测报告发布操作规程（唐山软件）核酸标本检测复检操作规程生物安全柜标准操作规程可移动紫外线灯标准操作规程低温高速离心机标准操作规程ABI7300型核酸扩增荧光检测仪标准操作规程第13页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202414

核酸实验室防污染措施主要的污染源扩增产物标本之间产生的气溶胶操作人员手衣服第14页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202415核酸实验室防污染措施要有独立的空气处理系统.各区始终处于完全分隔的状态，不能有空气的直接相通实验室保持合理的通风对各区内的设备、物料进行标示，专区专用；其他物品不得混用（例如：笔、纸张）空气：试剂准备区→标本制备区→扩增区→产物分析区试剂阳性对照储存在标本制备区使用带滤芯的吸头第15页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202416核酸实验室防污染措施使用外排式的生物安全柜自配试剂应分装成小规格，未用完的试剂应废弃使用次氯酸钠溶液消毒（台面、地面）使用1mol/L的HCL溶液（吸头）使用紫外线照射（空气和台面）使用无水乙醇溶液（空气喷雾）第16页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202417核酸实验室污染后措施实验室污染后，如何处理？通风次氯酸钠溶液（扩增区不宜使用）HCL溶液（吸头）紫外线（固定、移动）酒精喷洒（空气）应设计有备用实验室

:如开设独立的报告发放区作为备用第17页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202418中心理念：监测全程的实验过程包含病毒核酸提取、反转录及扩增过程的效率。血筛核酸检测的内标的作用内标的作用质控整个反应。提示假阴性检测结果。监控反应的外部条件内标浓度要合适保持适度的内标失控.(<0.2%)第18页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202419核酸试剂灵敏度评估概率单位回归分析(PROBIT）用于描述剂量-反应或不同因素间的剂量-反应比较，反应结果应该是以二分类形式表达的。概率单位的回归方程为：

PROBITPi=A+BXi第19页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202420

用国际标准品稀释成不同浓度评估血液HBV核酸筛查方法，结果如下。请计算95%的检出限量及可信范围CI

序号浓度（IU/ml）阳性数/重复数

概率15003/310021006/61003508/81004307/887.55104/850652/825710/50第20页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202421

AnalysisofParameterEstimates

Standard95%ConfidenceChi-

ParameterDFEstimateErrorLimitsSquarePr>ChiSq

Intercept1-4.68521.5659-7.7542-1.61618.950.0028

log10(Dose)14.80001.46991.91907.681010.660.0011

应用SAS9.0软件PROBIT分析结果第21页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202422

ProbitAnalysisonDoseProbabilityDose95%FiducialLimits0.509.570175.1203815.551100.5510.631756.0286917.840470.6011.831137.0273720.773340.6513.213168.1239224.640980.7014.844679.3358129.907500.7516.8320510.6994437.369630.8019.3597312.2864148.541110.8522.7890014.2417966.740000.9027.9795316.90417101.074790.9129.4011617.58727111.931570.9231.0275518.34915125.130150.9332.9198819.21204141.541650.9435.1700620.20878162.548510.9537.9247421.39086190.49822第22页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202423第23页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202424阳性献血者的追踪沟通原则:专业授权、人性化、保密、尊敬。沟通方式：电话、面谈沟通技巧：表扬和鼓励、合理解释、知情、适当的问候第24页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202425献血者核酸检测不合格解释由于核酸检测方法目前尚不能排除假阳性，对实验过程要求极高，另外乙肝和丙肝病毒进入人体后，人体又有清除现象，但血液不能用于临床，因此核酸检测不合格血液仅表示该血液不能用于临床输血。不作为献血者健康体检指标。更不宜作为疾病诊疗指标。献血者献血权利仍保留。第25页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202426关于核酸检测的解释汇集结果成反应性,拆分结果为阴性.内标失败.ELISA(+),核酸结果为(-)ELISA(-),核酸结果为(+)核酸单检结果反应性与血液发放.化学发光法与核酸检测.第26页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.2024271.灵敏度：汇集池大小要满足灵敏度要求。灵敏度太低，病毒低载量献血者漏检。HBVDNA灵敏度宜50拷贝/ml.2.引物是否有效性,能否检测亚型和突变株感染。3.假阳性，防污染措施（血筛主要要防止RNA酶的污染）。4.核酸提取效率与自动化.5.需要规范化场地和高素质的操作人员.6.参加国际间室间质控,提高检测水准.血液核酸筛查注意的问题第27页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202428深圳血液中心核酸检测概况对161228人份酶免疫检测结果阴性标本进行核酸检测，共检出33例不相同HBVDNA阳性献血者，总比率为1：4885。检出anti-HCV阴性、HCVRNA阳性1例，定量结果为1.2×105IU/ml。3个月后追踪结果发现anti-HCV（+），ALT由正常升高至700U/L。第28页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202429项目科华（自动化）科华（半自动化）美国罗氏上海浩源凯荣（CHIRON）方法学全自动提取+实时荧光PCR病毒离心富集+半自动提取+实时荧光PCR全自动提取+PCR-ELISA半自动提取+PCR+毛细管电泳分离TMA汇集量8×45ul8×150ul24×45ul5×200ul500ul单人份检测数6849637041315121412514603HBVDNA阳性数122838HBV阳性比率1：57081：185211：39391：47081：1825深圳血液中心核酸检测概况第29页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202430HBVDNA阳性献血者追踪情况

对17位HBVDNA阳性献血者进行了追踪，9位献血者发生血清转换现象。4例呈窗口期特征（或部分），2例献血者发现病毒感染后自愈现象1例献血者原为乙肝大三阳患者，经治疗后HBsAg转阴后，献血，常规检测为合格，核酸检测HBVDNA（+），经追踪后HBsAg变为阳性第30页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202431第31页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202432第32页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202433第33页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202434第34页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202435第35页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.202436

HBVDNA检测阳性献血者追踪概况追踪时间(d)ALT（IU/L）HBsAgHBsAg抗-HBs抗-HBcHBeAg抗-HBeDNA（cp/ml）1(03/10/23)18－－－＋－＋+2124－－－＋－＋1504528＋－－＋－＋未检出9126＋－－＋－＋未检出15631＋－－＋－＋未检出21429＋－－＋－＋未检出第36页,共46页，2024年2月25日，星期天15.04.2024371号献血者在追踪时表明曾经是大三阳,治疗转阴后献血,被核酸检出阳性,7天后HBsAg检测(+).