蛋白质的定性定量分析

关于蛋白质的定性定量分析

蛋白质定性分析

(qualitativeanalysis)

确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的是何种蛋白质

蛋白质定量分析

(quantitativeanalysis)

确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白成分的含量第2页,共59页，2024年2月25日，星期天

蛋白质含量的测定方法（重点掌握）

蛋白质相对分子量测定(SDS)

等电聚焦电泳(IEF)（一般了解）

蛋白质的免疫印迹分析

(westernblot)第3页,共59页，2024年2月25日，星期天第一章蛋白质的含量测定蛋白质的含量测定基于蛋白质的元素组成特点基于蛋白质的化学显色反应基于蛋白质的光吸收特性第4页,共59页，2024年2月25日，星期天

蛋白质元素组成的特点各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％

由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数×6.25×1001/16%第5页,共59页，2024年2月25日，星期天一、紫外光谱(A280)吸收法

这一方法可用来快速检测溶液中是否含有蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋白质的洗脱峰第6页,共59页，2024年2月25日，星期天原理

色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm附近

大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法芳香族氨基酸的紫外吸收第7页,共59页，2024年2月25日，星期天优点

快速缺点

核酸可引起强干扰作用芳香族氨基酸含量差异可以起误差

对蛋白质无破坏性

不是严格的定量，适用于测定蛋白质粗提液第8页,共59页，2024年2月25日，星期天计算方法

标准曲线法

蛋白质浓度(mg/ml)=1.45×A280-0.74×A260注意事项

石英比色杯

调零所用溶液

配制标准蛋白所用溶液

光密度范围第9页,共59页，2024年2月25日，星期天二、考马斯亮蓝G-250检测法

这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质含量的方法第10页,共59页，2024年2月25日，星期天原理

该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物在595mn波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测595mn的光吸收值大小计算蛋白的含量第11页,共59页，2024年2月25日，星期天所需时间10min优点

快速（反应时间仅需2min）

敏感，几乎没有蛋白质损失缺点

用这种测定方法对蛋白质引起不可逆的变性

对各种纯化蛋白质反应不同第12页,共59页，2024年2月25日，星期天计算方法

标准曲线法注意事项

反应10～15min后开始出现沉淀，尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条件下易发生沉淀

若选用目的蛋白来做标准曲线或用另一种方法来校正，所测蛋白浓度较准确第13页,共59页，2024年2月25日，星期天三、Lowry检测法

这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已得到广泛应用.第14页,共59页，2024年2月25日，星期天原理

首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin-酚试剂)，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的复合物在745～750nm处有最大的吸收峰，颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比，可根据750nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量第15页,共59页，2024年2月25日，星期天优点

一种可靠的蛋白质定量方法

不同蛋白质之间差别很小缺点

某些试剂不稳定

干扰物质多

使蛋白质发生不可逆变性第16页,共59页，2024年2月25日，星期天计算方法

标准曲线法注意事项

在加入试剂30min后呈色达到饱和，时间延长颜色信号减弱

许多干扰物质降低颜色反应

高盐浓度可引起沉淀第17页,共59页，2024年2月25日，星期天四、BCA(二喹啉甲酸)检测法

这是近年来新研制的一种改进的Lowry测定法第18页,共59页，2024年2月25日，星期天原理

在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与Cu2＋生成络合物，同时将Cu2＋还原成Cu＋。而BCA试剂可敏感特异地与Cu＋结合，形成稳定的有颜色的复合物，在562nm处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量第19页,共59页，2024年2月25日，星期天优点

检测敏感性高缺点

蛋白质发生不可逆的变性

终产物稳定巯基试剂和去垢剂干扰第20页,共59页，2024年2月25日，星期天第二节蛋白质相对分子量测定分子量测定(molecularweight,MW)排阻层析沉降平衡超速离心动态弹性光散射孔径梯度电泳质谱(ESI-MS)第21页,共59页，2024年2月25日，星期天一、SDS测定蛋白质的相对分子量1.不连续系统原理2.SDS凝胶的制备制备分离胶制备浓缩胶加样装板电泳卸板并进行凝胶染色第22页,共59页，2024年2月25日，星期天3.SDS基本原理SDS

影响迁移率的因素

十二烷基硫酸钠

(SodiumDodecylSulfate)

十二烷基磺酸钠

(SodiumDodecylSulfonate)

第23页,共59页，2024年2月25日，星期天SDS作用：与蛋白牢固结合，当其浓度大于1mmol/L时，SDS与蛋白质的结合比例为1.4gSDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异第24页,共59页，2024年2月25日，星期天SDS-蛋白质复合物分子构型也几乎相同(雪茄烟形的长椭圆棒状的复合物)，而且具有相同的荷质比，因此在SDS中，SDS-蛋白质复合物的电泳迁移率只与其分子量有关，而不再受所带电荷及分子形状的影响，且在一定条件下，迁移率与分子量呈对数线性关系WatchSDS原理第25页,共59页，2024年2月25日，星期天4.SDS测定分子量的操作

标准品的选择及处理

待测样品的制备

电泳分离及染色

相对迁移率的计算WatchSDS操作第26页,共59页，2024年2月25日，星期天AnalysisforSDSelectrophoresis第27页,共59页，2024年2月25日，星期天5.注意事项

选择合适的胶浓度

样品中高浓度的阳离子可能会导致SDS的沉淀，应在加入样品缓冲液之前将其除去SDS与蛋白质之间的结合程度

蛋白质的分子量范围15～200KD之间

二硫键是否完全被还原

溶液中SDS的浓度

溶液的离子强度第28页,共59页，2024年2月25日，星期天

多亚基蛋白质分子量检测

用其它方法测定分子量进行参照SDS和巯基乙醇SDS测定的准确性

电荷异常或构象异常

带有较大辅基的蛋白质

某些结构蛋白第29页,共59页，2024年2月25日，星期天二、凝胶过滤层析测定蛋白质的相对分子量1.基本原理2.凝胶过滤测定分子量的操作

分子筛效应

洗脱体积与相应分子量的关系装柱平衡加样平衡洗脱收集样品并计算Ve绘制标准曲线第30页,共59页，2024年2月25日，星期天第31页,共59页，2024年2月25日，星期天3.注意事项

柱床表面不能干燥

凝胶的选择Sephadex溶胀G值的意义

凝胶柱的再生与保存第32页,共59页，2024年2月25日，星期天第三节

等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点第33页,共59页，2024年2月25日，星期天等电点(isoelectricpoint,pI)两性电解质性质支持介质(supportingmedia)FigureofIEF第34页,共59页，2024年2月25日，星期天+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10IsoelectricFocusing第35页,共59页，2024年2月25日，星期天ReadyStripTMIPGStrips3–104–73–65–87–103–10NL3.9–5.14.7–5.95.5-6.76.3-8.3High-puritymonomersNarrowrangesforresolutionoflow-abundanceproteinsOverlappinggradientsfor“cybergels”Threelengths7cm,11cmand17cm0.5mmx3.3mm第36页,共59页，2024年2月25日，星期天BroadRangepH3-10NarrowRangepH4-7MicroRangepH4.7-5.931044774.75.94.75.9第37页,共59页，2024年2月25日，星期天注意事项

两性电解质的选择

电极缓冲液

对样品的要求

样品必须无盐

加样的量要适当

加样方法

加样位置第38页,共59页，2024年2月25日，星期天第四节

蛋白质的免疫印迹分析第39页,共59页，2024年2月25日，星期天

印迹技术(blotting)是指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术

1975年，EdwenSouthern提出了分子印迹(渍)的概念目前这种技术已被广泛用于DNA、RNA和蛋白质的检测第40页,共59页，2024年2月25日，星期天印迹技术的类别及应用

DNA印迹技术(Southernblotting)

用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析

RNA印迹技术(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析

蛋白质的印迹分析(Westernblotting)

用于蛋白质定性定量及相互作用研究由于蛋白质常用抗体来检测，因此也被称为免疫印迹技术(immunoblotting)第41页,共59页，2024年2月25日，星期天一、免疫印迹分析的应用对蛋白质进行定性分析对蛋白质进行半定量分析信号转导分析生物大分子相互作用分析第42页,共59页，2024年2月25日，星期天将蛋白质固定在膜上的其他应用

结构域分析斑点印迹抗体纯化为制备抗体时获得相应的蛋白质抗原蛋白质鉴定：氨基酸组成分析和序列分析第43页,共59页，2024年2月25日，星期天二、免疫印迹分析的基本流程

电泳分离蛋白

转移至固相膜

封闭非特异结合位点

与第一抗体温育反应

与第二抗体交联物温育反应

显色制备蛋白样品蛋白质转移抗体检测第44页,共59页，2024年2月25日，星期天免疫印迹操作流程图第45页,共59页，2024年2月25日，星期天1.样品的制备

组织或细胞中提取

裂解

去污剂(SDS、TritonX-100、NP-40、Tween-20)

蛋白酶抑制剂(PMSF、EDTA、Pepstatin、

Leupeptin、Aprotinin)

蛋白质的定量(Bradford、BCA、Lowry)

基因工程表达重组产物第46页,共59页，2024年2月25日，星期天2.电泳分离

SDS

非变性PAGEEIF第47页,共59页，2024年2月25日，星期天3.蛋白质的电转移方法：半干法、湿法

作用：将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上

注意：在叠放硝酸纤维素膜、聚丙烯酰胺凝胶时，膜与胶之间要紧密贴在一起，中间不能有任何气泡！？第48页,共59页，2024年2月25日，星期天常用的蛋白质转移膜种类微孔大小结合能力特点NC膜0.45um80-100ug/cm2应用广泛<20kD易丢失PVDF膜0.22um0.45um80-100ug/cm2170-200ug/cm2<20kD不易丢失容量大、强度高尼龙膜480ug/cm2用于核酸第49页,共59页，2024年2月25日，星期天电转移装置第50页,共59页，2024年2月25日，星期天电转移示意图第51页,共59页，2024年2月25日，星期天电转移装置第52页,共59页，2024年2月25日，星期天4.靶蛋白的免疫学检测

封闭

—对转移膜上的潜在结合位点进行封闭，防止抗体非特异性结合在膜上，降低背景颜色BSA、脱脂奶粉第53页,共59页，2024年2月25日，星期天第54页,共59页，2024年2月25日，星期天

靶