【生物】重组DNA技术的基本工具课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。普通棉花如何能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种呢？转基因抗虫棉第3章基因工程将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因转入普通棉花1.基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，通过________等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做__________技术。

例如，通过重组DNA技术，可以实现利用大肠杆菌生产人的胰岛素。在此实例中，目的基因是_______________，受体细胞是________________，目的基因的表达产物是____________。

转基因重组DNA人胰岛素基因大肠杆菌细胞人胰岛素2.对基因工程概念的理解：基因工程的别名：操作对象：操作水平：基本过程：

原理：

结果：重组DNA技术、转基因技术基因DNA分子水平剪切→拼接→导入→表达基因重组创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品克服远缘杂交不亲和障碍、定向改造生物性状

优点：“分子手术刀”“分子缝合针”“分子运输车”3.基因工程理论基础的分析【问题探究1】为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？（1）DNA的基本组成单位都是

。（2）双链DNA分子的空间结构都是

。【问题探究2】为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？（1）

是控制生物性状的独立遗传单位。（2）遗传信息的传递和表达都遵循

。（3）生物界共用一套

。四种脱氧核苷酸规则的双螺旋结构基因中心法则遗传密码ATGC腺嘌呤胸腺嘧啶胞嘧啶鸟嘌呤4种脱氧核苷酸种类？o1’2’3’4’5’脱氧核糖【回顾】DNADNA的基本单位？脱氧（核糖）核苷酸中文全称？脱氧核糖核酸一条脱氧核苷酸链…（3’、5’）磷酸二酯键5′5′3′3′AP脱氧核糖GP脱氧核糖TP脱氧核糖CP脱氧核糖脱氧核糖GPAPCPTP脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖氢键DNA的平面结构一端有一个游离的磷酸基团另一端有一个羟基（—OH）科技探索之路基因工程的诞生与发展基因工程发展历程1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至19666年，64个密码子均被破译成功。1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶）1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。《金》P81例1、例2【从社会中来】番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒侵染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。转基因番木瓜DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？培育转基因番木瓜“分子手术刀”准确切割DNA分子“分子缝合针”“分子运输车”将DNA片段连接起来将体外重组好的DNA分子导入受体细胞磷酸二酯键1.来源：2.功能：3.作用的化学键：磷酸二酯键主要从

中分离纯化出来，目前分离出数千种。识别双链DNA分子特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开磷酸二酯键原核生物注意：限制酶是一类酶，而不是一种酶。（酶的专一性）EcoRⅠ限制性内切核酸酶一“分子手术刀”——（简称限制酶）4.识别序列长度：5.结果：限制酶识别序列的长度一般为4-8个或其他数量的核苷酸，最常见的为6个核苷酸。产生黏性末端或平末端EcoRⅠ：专一识别GAATTC的序列，并使G和A之间的磷酸二酯键断开。A.形成的黏性末端（从5’往3’读）为________B.一个限制酶切割一次断两个磷酸二酯键形成___个黏性末端C.两个黏性末端有___个游离的磷酸基团，消耗

分子水D.同一种限制酶切割形成的黏性末端________AATT两相同2黏性末端（1）被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。两中轴线平末端SmaI：专一识别CCCGGG的序列，并使G和C之间的磷酸二酯键断开。（2）当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。重组DNA分子的模拟操作P73：请在两张纸上分别写上下列两段DNA序列：1、找到两条片段上EcoRI限制酶识别的序列和切割位点，然后用剪刀进行“切割”识别序列GAATTC【问题探究1】请判断：以下黏性末端是由

种限制酶作用产生的。3①②③结论：不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端【问题探究2】下图甲是一个DNA片段，箭头处代表不同限制酶的切点，据图回答：（1）用EcoRⅠ酶切，能得到

种DNA片段；（2）用PstⅠ完全酶切，能得到

种DNA片段；（3）同时用SmaⅠ和PstⅠ完全酶切，能得到

种DNA片段；（4）只用PstⅠ酶切，最多能得到

种DNA片段。2355细菌等原核生物容易受到自然界外源DNA（如噬菌体）的入侵。所以它在长期的进化过程中形成了套完善的防御机制。这类原核生物之所以长期进化而不灭绝，限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。思考：1.根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？2.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子?细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。细菌自身的DNA没有限制酶识别的特定序列或者识别序列被修饰（甲基化），所以不会限制酶切割自身的DNA。【课后题拓展应用2】有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割，各限制酶的识别序列和切割位点如下：(1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割的A片段产生的DNA片段相连接，为什么？XbaⅠ因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端（可互补）结论：不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义?

识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。“分子缝合针”——二DNA连接酶将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。1.作用：2.DNA连接酶—“分子缝合针”3.种类：类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源________________________功能只缝合____________缝合____________和____________结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________大肠杆菌T4噬菌体黏性末端黏性末端平末端磷酸二酯键磷酸二酯键2.作用部位：两个DNA片段要具有互补（相同的）黏性末端才能连接起来把两个DNA片段黏性末端间的缝隙“缝合”起来，注意：DNA连接酶可连接两个双链DNA片段中的DNA单链缺口，但不能直接连接两条单链的DNA！（1）.E·coliDNA连接酶的缝合作用：DNA连接酶将两个双链DNA片段“缝合”连接起来，形成一个双链DNA分子，恢复被限制酶切开的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。T4DNA连接酶还可以把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率相对较低。（1）.T4DNA连接酶的缝合作用：？插入的DNA片段能称得上一个基因吗？不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。CAATTGAGTATCDNA聚合酶连接单个脱氧核苷酸形成单链DNA聚合酶作用示意图：易混易错DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果 用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质

不需要需要DNA的一条链作模板形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键名称作用部位作用底物作用结果限制酶DNA连接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶归纳总结——与DNA相关的五种酶的比较DNA磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对之间的氢键将双链DNA切成两个或多个片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸将双链DNA分子局部解旋为单链DNADNA片段脱氧核苷酸磷酸二酯键DNA《金》P81点拨提高将外源基因送入受体细胞，相当于一种运输工具，比喻为“分子运输车”1.种类：质粒、噬菌体和动植物病毒等。种类用途不同点质粒、噬菌体植物病毒动物病毒将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞将外源基因导入植物细胞将外源基因导入动物细胞来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”三2.最常用的载体——质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。DNA分子复制的起点特殊的标记基因用于鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞标记基因通常有:①抗生素的抗性基因，如:抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr)②荧光蛋白基因，如:绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)质粒有___个游离的磷酸基团03.★载体作为载体所具备的条件及原因①有一个至多个限制酶切割位点供外源DNA片段（基因）插入其中②在受体细胞中稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制，以扩增外源基因的数量③具有特殊的标记基因便于重组DNA分子的筛选④无毒害作用避免受体细胞受到损伤4.质粒的作用①作为运输工具，将外源基因导入受体细胞。②质粒携带外源DNA片段在细胞内大量复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的AATTCGGCATAC……TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGGCCGTATG…目的基因…

TCCTAG…

AGGATCTTAAAATTCCATAC…

GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG…实例：

重组DNA分子的模拟操作1、选目的基因两端和运载体都有的酶切位点；2、所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因规律：---选择酶切位点的原则：《金》P82例4、P8371.“分子手术刀”——

1）来源：

2）作用：

3）作用结果：2.“分子缝合线”——

1）作用：

2）分类：3.“分子运输车”——

1）作用：

2）种类：

3）应具备条件：

限制酶

产生黏性末端、平末端

DNA连接酶将不同的DNA片段连接起来磷酸二酯键将外源基因送入受体细胞质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒E.ColiDNA连接酶、T4DNA连接酶（来源、区别？）主要从原核生物中分离纯化出来。载体识别特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开。作用部位：②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。①有一个至多个限制酶切割位点③具有标记基因④对受体细胞无害——便于重组DNA分子的筛选——供外源DNA片段（目的基因）插入其中小结：基因工程的基本工具用限制酶切割时需注意的事项(1)获取目的基因和切割载体时,通常使用同种限制酶,目的是

。但是使用该法缺点是容易发生

，为了避免上述情况发生，可采取的措施是

。(2)获取一个目的基因需限制酶切割

次,共产生

个游离的磷酸基团。(3)选择限制酶切割位点的基本原则：

①切割目的基因时：

。②切割质粒时：

。为了产生相同的黏性末端，便于连接两4分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接能切下目的基因且不破坏目的基因至少保留一个完整的标记基因，便于筛选练习与应用《金》P8517利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。DNA粗提取的原理2.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同1.DNA不溶于酒精溶液DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可初步分离DNA与蛋白质。在NaCl溶液中的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。探究-实践DNA的粗提取与鉴定在沸水浴的条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色。3.DNA的鉴定当NaCl的物质的量浓度为2mol/L时，DNA的溶解度最大；浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出。不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。你认为如下提供的材料中哪些不适合提取DNA？为什么？供选材料：（括号内为染色体条数）新鲜洋葱（16）、香蕉、菠菜（12）、菜花、猕猴桃（58）；猪肝（38）、鱼卵、鸡血（78）、哺乳动物的成熟红细胞；在液体培养基中培养的大肠杆菌（1）原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑；选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。1、实验材料的选取材料用具利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。以血液为实验材料时，每100mL