结核分枝杆菌全基因组测序质量控制要求（征求意见稿）

1T/SASXXXX—XXXX结核分枝杆菌全基因组测序质量控制通用要求本文件规定了结核分枝杆菌全基因组测序质量控制通用要求，包括样本基因组DNA纯度和完整性、基因文库构建起始DNA量、测序读长、碱基识别质量值、平均覆盖深度和比对率的最低要求。本文件适用于应用高通量基因组测序对结核分枝杆菌菌株样本进行全基因组测序质量控制的规范。本文件不适用于其他类型标本及单分子测序。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析试验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T35537—2017高通量基因测序结果评价要求GB/T40226—2021环境微生物宏基因组检测高通量测序法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1基因组genome一种生物体具有的所有遗传信息的总和。[来源：GB/T30989—2014，3.2]3.2核苷酸nucleotide构成核酸的基本单位，由三部分组成：五碳糖、磷酸和环状的含氮碱基。[来源：GB/T30989—2014，3.3]3.3基因文库genelibrary整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆的总和。[来源：GB/T30989—2014，3.7]3.4碱基对basepair形成“DNA梯子的横档”的一对碱基。注：在碱基对中，腺嘌呤总是与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤与胞嘧啶配对。[来源：GB/T30989—2014，3.17]3.5测序读长readlengthofgenesequencing测序能测得的最长基因片段的长度，通常以碱基数表示[来源：GB/T30989—2014，3.24]3.6碱基识别质量qualityofbasecalling评价碱基准确识别的概率。注：简称为Q，通常以数值表示，碱基识别质量值与碱基识别错误率负相关，二者遵循对数函数关系。碱基识别质2T/SASXXXX—XXXX[来源：GB/T40226—2021，3.4]3.7Q20测序数据中，碱基识别质量为20的碱基识别准确率为99%，或错误率为1%。[来源：GB/T40226—2021，3.5]3.8Q30测序数据中，碱基识别质量为30的碱基识别准确率为99.9%，或错误率为0.1%。[来源：GB/T40226—2021，3.6]3.9测序深度depthofsequencing待测样本中某个指定的核苷酸被检测的次数。[来源：GB/T30989—2014，3.31]3.10平均覆盖深度averagedepthofcoverage测序深度的平均值。[来源：GB/T30989—2014，3.32]4缩略语下列缩略语适用于本文件。bp：碱基对（BasePair）DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）OD：光密度（OpticalDensity）PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）5原理运用高通量测序技术进行结核分枝杆菌全基因组测序，分别对样本灭活、保存、运输、接收、处理、DNA提取、基因文库构建、高通量测序和数据质控各个环节进行规范。6实验室及生物安全要求6.1实验室设施和设备要求应符合GB19489的规定。6.2实验室用水应符合GB/T6682的规定6.3实验室应做到防止污染，应根据不同工作内容划分独立区域，并有明显标志，如试剂储备和准备区，样品制备区，扩增区等，各区域间应避免交叉污染。6.4根据我国《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《人间传染的病原微生物目录》和《医疗机构临床实验室管理办法》的要求，结核分枝杆菌样本灭活可在生物安全二级（BSL-2）实验室中进行，并遵守BSL-2实验室操作规范。7试剂7.1DNA提取试剂。7.2PCR产物纯化试剂。7.3荧光定量检测试剂。7.4文库制备试剂。7.5高通量测序试剂。8仪器设备3T/SASXXXX—XXXX8.1二级生物安全柜。8.2压力蒸汽灭菌器。8.3高通量测序仪。8.4PCR仪。8.5冷冻离心机：最大离心力12000×g以上。8.6微量移液器。8.7紫外分光光度计。8.8荧光定量仪。8.9电泳仪。8.10凝胶成像系统。8.11水浴锅。8.12低温冰箱20℃和－80℃。9样本9.1样本灭活、保存和运输。9.1.1样本若采用固体培养基分离培养，则于生物安全柜内用无菌的接种环收集培养物并重悬于300μL无DNA酶的双蒸水中备用。9.1.2样本若采用液体培养基分离培养，则于生物安全柜内吸取1mL培养液加入离心管内，12000×g离心10min；弃上清，向沉淀加入300μL无DNA酶的双蒸水重悬。9.1.3样本经80℃水浴30min灭活后方可从BSL-2实验室转出。9.1.4灭活后样本应立即置于－20℃保存80℃长期保存；避免反复冻融；禁止室温存放超过30min。9.1.5样本的转运应在干冰条件下进行运输。9.2样本接收与处理应核对样本编号，记录样本信息，检查样本状态，避免密封不严导致泄漏或污染等，否则该样本应废弃，重新采样。10试验步骤10.1DNA提取10.1.1原理将灭活的菌株样本悬浮于裂解缓冲液中，通过抽提等步骤提取结核分枝杆菌基因组DNA，充分去除样品中的蛋白质、脂类、多糖、RNA等杂质。宜选用手工提取方法或相应DNA提取试剂盒。10.1.2DNA样本纯度、浓度和完整性检测菌株样品提取结核分枝杆菌基因组DNA后，应使用紫外分光光度计检测DNA样本纯度，按GB/T37875—2019附录A进行。应使用荧光定量仪检测DNA样本浓度，使用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA样本完整性，完整性判断依据见GB/T40226—2021附录E.1。10.1.3DNA样本保存提取后的DNA样本应立即置于－20℃保存80℃长期保存；避免反复冻融；禁止室温存放超过30min。10.2基因文库构建与高通量测序10.2.1基因文库构建质量控制要求应使用合格的结核分枝杆菌基因组DNA样本以及合适的文库制备试剂进行基因文库构建。结核分枝4T/SASXXXX—XXXX杆菌基因组DNA样本质量要求应通过纯度、完整性和基因文库构建起始DNA量确定。10.2.1.1结核分枝杆菌基因组DNA样本的纯度OD260∕OD280≈1.8（1.8～2.0）；OD260∕OD230＞2.0（2.0～2.5）。10.2.1.2结核分枝杆菌基因组DNA样本的完整性无降解或轻微降解的基因组DNA样本可进行基因文库构建；中度降解的基因组DNA样本可尝试进行基因文库构建；重度降解的基因组DNA样本为不合格样本。10.2.1.3基因文库构建起始DNA量基因文库构建起始DNA量应大于或等于50ng。10.2.2高通量测序质量控制要求应使用合适的基因文库和高通量测序试剂进行高通量测序。高通量测序按GB/T35537-2017的附录A进行。结核分枝杆菌全基因组测序读长应为2×150bp。11数据质控11.1质控步骤结核分枝杆菌基因组DNA样本经过高通量测序的原始数据，应进行质量控制，去除含接头或低质量的序列、评估比对到结核分枝杆菌标准菌株（H37Rv）参考序列（NC_000962.3）测序数据的平均测序深度和比对率。11.2碱基识别质量值测序完成后，应进行Q20、Q30的统计和评估。每个样本可用数据对应的碱基识别质量值应符合如下要求：——大于Q20的碱基比例≥90%；——大于Q30的碱基比例≥80%。11.3平均覆盖深度数据质控后对样本测序数据与结核分枝杆菌标准菌株（H37Rv）参考序列（NC_000962.3）进行比对，统计参考序列上每个核苷酸的测序深度，获得平均覆盖深度。结核分枝杆菌全基因组测序平均覆盖深度应大于或等于60倍。11.4比对率数据质控后对样本测序数据与结核分枝杆菌标准菌株（H37Rv）参考序列（NC_000962.3）进行比对，计算比对到参考序列的测序数据占质控后总测序数据的比例。结核分枝杆菌全基因组测序基因组比对率应大于或等于99%。5T/SASXXXX—XXXX参考文献[1]GB/T30989—2014高通量基因测序技术规程[2]GB/T37872—20