DB32T 4727-2024鳜鱼传染性脾肾坏死病诊断及综合防控技术规程

ICS65.150CCSB52江苏省地方标准鳜鱼传染性脾肾坏死病诊断及综合防控技术规程2024-04-03发布2024-05-03实施江苏省市场监督管理局发布Ⅰ本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江苏省农业农村厅提出。本文件由江苏省渔业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：扬州大学。1鳜鱼传染性脾肾坏死病诊断及综合防控技术规程本文件规定了鳜鱼传染性脾肾坏死病的诊断、综合防控和记录。本文件适用于鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的检测以及鳜鱼传染性脾肾坏死病的诊断和综合防控。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB11607渔业水质标准SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4.1现场调查4.2临床诊断患病鱼表现为沿池边漫游而死，鳃盖、口腔周围、下颌、胸鳍、腹鳍充血，鳃发白，解剖后肝脏呈现白色或有出血点，肾脏和脾脏肿大或有明显的出血点，部分胆囊肿大，部分幽门盲囊出血（见附录A图A.1）。4.3检测方法4.3.1试剂材料试剂材料：a)无水乙醇（分析纯b)三氯甲烷（分析纯d)1mmol/L乙二胺四乙酸（EDTApH8.0；e)1%十二烷基硫酸钠（SDS2O；2DB32/T4727—2024g)10mmol/LTris⁃HCl，pH8.0，4℃保存；h)Tris饱和酚，4℃保存；i)8U/µLBstDNA聚合酶，-20℃保存；j)10mmol/LdNTPs混合物（dATP、dTTP、dCTP、dGTP各2.5mmol/L-20℃保存；k)10000×SYBRGreenI，-20℃保存；l)25mmol/LMgCl2，-20℃保存；m)10×LAMP缓冲液，-20℃保存；n)5mol/L甜菜碱，-20℃保存；o)10×PCR缓冲液，-20℃保存；p)5U/µLTaqDNA聚合酶，-20℃保存；q)20mg/mL蛋白酶K，-20℃保存；r)LAMP检测引物序列：′⁃AACCACCAGGCAGAAATGG⁃3′′⁃ATCCGAGGCGACGTCATC⁃3′′⁃TAAAGCCAAAGCCCACATCGGCGAAGACATGGTGCGCTACT⁃3′′⁃AAGCAAGTGCACAGCACCCGTCAAGCCTCGCACAGAGG⁃3′s)巢氏PCR检测引物序列：MCP⁃F1：5′⁃ATGTCTGCAATCTCAGGT⁃3′MCP⁃R1：5′⁃TTACAGGATAGGGAAGCCTG⁃3′MCP⁃F2：5′⁃GCGTTTGATGCGATGGAGAC⁃3′MCP⁃R2：5′⁃ACGGCAGAGACACGGTAGGC⁃3′4.3.2仪器设备仪器设备包括：a）灭菌锅；b）水浴锅；c）PCR仪；d）紫外分光光度计；e）电泳仪；f）电泳槽；g）凝胶成像系统；h）离心机。4.3.3采样采集样品的数量见SC/T7103。鳜鱼体表用75%酒精消毒后解剖剪解剖，无菌操作，剪取小块肾4.3.4检测样本模板制备利用酚⁃氯仿（三氯甲烷）法抽提混合组织DNA。每个样品取组织100mg~200mg，匀浆后置于1.5mL微量离心管，加入含蛋白酶K的裂解液（10mmol/LTris⁃HCl，pH8.0；1mmol/LEDTA，pH8.0；1%SDS60℃消化1h~3h。用Tris饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇（25∶24∶1）混合液提取、纯化DNA，-20℃冷冻的无水乙醇沉淀3DB32/T4727—2024DNA，自然干燥，溶于灭菌ddH2O。紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。DNA样品置于-20℃冰箱保存备用。4.3.5环介导等温扩增（LAMP）检测方法4.3.5.1LAMP扩增按表1加入各项试剂进行LAMP扩增，同时以ddH2O为模板作阴性对照，以病毒质粒作阳性对照，LAMP的反应条件：65℃保持60min，80℃终止反应10min。表1LAMP反应体系（25μL）试剂体积µLDNA模板2各1各1dNTPs（10mmol/L）10×LAMP缓冲液甜菜碱（5mol/L）4MgCl2（25mmol/L）2BstDNA聚合酶（8U/µL）1ddH2O补足至254.3.5.2LAMP检测结果判断将1μL10000×SYBRGreenI荧光染料加入LAMP反应产物，振荡后观察混合液颜色，绿色为阳4.3.6巢式PCR检测方法4.3.6.1PCR扩增按表2加入试剂进行第一轮PCR扩增，同时以ddH2O为模板作阴性对照，以病毒质粒作阳性对照，延伸10min。表2第一轮扩增反应体系（25μL）试剂体积μLDNA模板1MCP⁃F1MCP⁃R110×PCR缓冲液4DB32/T4727—2024表2第一轮扩增反应体系（25μL）(续)试剂体积μLMgCl2（25mmol/L）2dNTPs（10mmol/L）1TaqDNA聚合酶（5U/µL）ddH2O补足至25按表3加入试剂进行第二轮PCR扩增，以ddH2O为模板作阴性对照，以病毒质粒作阳性对照，PCR表3第二轮扩增反应体系（25μL）试剂体积μLDNA模板（第一轮PCR扩增产物）1MCP⁃F2MCP⁃R210×PCR缓冲液MgCl2（25mmol/L）2dNTP（10mmol/L）2TaqDNA聚合酶（5U/µL）ddH2O补足至254.3.6.2巢氏PCR检测结果判断反应结束后，取5μLPCR产物，用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析，采用凝胶成像系统观察并记录结果，第一轮阳性扩增片段的大小为1362bp，第二轮阳性扩增片段的大小为526bp，阴性无扩增片段（见4.3.7综合判定结合现场调查、临床症状和分子生物学检测结果，诊断结论如下：a）有临床症状，分子诊断阳性的，判定鳜鱼患传染性脾肾坏死病；b）无临床症状，分子诊断阳性的，判定鳜鱼携带传染性脾肾坏死病毒；c）无临床症状，分子诊断阴性的，判定鳜鱼未患传染性脾肾坏死病。55综合防控5.1养殖前准备工作5.1.1养殖用水水源应符合GB11607渔业水质标准。5.1.2池塘准备5.1.2.1池塘清整冬季在捕捞后，排干池水，维修堤埂滩脚，并清除池底过多淤泥及池边杂草，晒池和冻池。5.1.2.2生石灰清塘生石灰清塘包括：b）带水清塘：按20kg/100m3~50kg/100m3生石灰化浆后全池泼洒。5.1.2.3漂白粉清塘漂白粉含有效氯≥28%。漂白粉清塘包括：b）带水清塘：用量2kg/100m3~5kg/100m3，先将漂白粉加水溶化后，立即全池泼洒。5.1.3苗种检疫苗种放养前进行传染性脾肾坏死病毒检测。5.1.4疫苗注射鳜鱼苗种下塘前，按照说明书注射国家批准的鳜传染性脾肾坏死病灭活疫苗（NH0618株）。5.1.5苗种放养苗种放养前，先放“试水鱼”，确认安全后，按照生产计划放养。5.2养殖过程管理5.2.1水质调控鳜鱼养殖池塘水体溶解氧宜≥5mg/L，透明度宜≥30cm，pH宜为7.5~8.5，每隔10d~15d，使用生物型底质改良剂和水质改良剂各1次。5.2.2饵料投喂投喂的饵料鱼不携带传染性脾肾坏死病毒，规格不超过鳜鱼全长的50%，投喂前用3%~5%食盐水浸泡10min~15min消毒。5.2.3疾病高发期管理水温25℃~30℃时为鳜鱼传染性脾肾坏死病发病高峰期，每10d用微生物制剂调节水质进行预6防；疾病发生后及时捞除病鱼及死鱼，无害化处理；减少或停止投喂饵料；使用聚维酮碘等药物对水体消毒1次~2次，防止交叉感染。详细记录实际防控措施，记录保存2年以上。记录内容应包含苗种及饵料鱼来源、用药量、用药方法、病鱼死亡情况等。实际操作与复核人员需在记录上签字。7（资料性）鳜鱼传染性脾肾坏死病临床症状及LAMP和巢式PCR检测结果示意图鳜鱼传染性脾肾坏死病临床症状见图A.1。标引序号说明：A——鳃盖、口腔周围、下颌出血；B——鳃丝发白；C——肝脏发白；D——胆囊肿大；E——肾脏肿大；F——脾脏肿大。图A.1鳜鱼传染性脾肾坏死病临床症状鳜鱼传染性脾肾坏死病毒LAMP检测结果见图A.2。8标引序号说明：1——阳性样本；2——阳性对照；3——阴性对照。图A.2鳜鱼传染性脾肾坏死病毒LAMP检测结果鳜鱼传染性脾肾坏死病毒巢式PCR检测结果见图A