医学分子生物学第21章 基因诊断

第21章基因诊断GeneDiagnosis

References《医学分子生物学》（七年制统编教材）冯作化主编人民卫生出版社

《医学分子生物学》（第3版）药立波主编人民卫生出版社

2实验室诊断技术发展简史第四类20世纪80年代第三类20世纪60年代第二类20世纪50年代第一类基因诊断免疫学检验代谢产物、酶活性变化细胞学检查3基因变异致病

（1）内源基因的变异基因结构突变基因表达异常

（2）外源基因的入侵

点突变、缺失、插入易位、重排、扩增基因变异疾病4先天遗传性疾患——如镰刀型贫血、白化病、红绿色盲后天基因突变引起的疾病——如癌症、心血管疾病基因变异致病5肿瘤的早期基因诊断6基因诊断一、基因诊断概述二、常用技术与方法三、应用概念基本原理特点临床意义7第一节

基因诊断概述指利用现代分子生物学和分子遗传学方法，通过检测基因的结构或表达功能的异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。基因水平的病因诊断基因诊断对象：DNA/RNA前提：已确定疾病表型与基因型的关系1.概念92.特点（2）特异性强、灵敏度高：由于基因诊断采用核酸分子杂交、聚合酶链反应等技术；（3）适用范围广：健康预警、产前诊断、疾病易感性、药物敏感性、病原体基因分型等。（1）直接检测基因，属病因诊断，针对性强；103.临床意义

对有表型出现的疾病作出明确诊断

早期快速诊断

确定个体对疾病的易感性疾病的分期分型、疗效监测、预后判断等11症状前筛查检查对象：晚发型、高易感性、高风险性疾病或恶性肿瘤。

类型疾病名称易感、或致病基因可选择的预防、治疗措施晚发型遗甲状腺髓质瘤RET预防性手术切除传病成人型多囊肾多囊肾基因预防性手术切除、其他治疗遗传病易肝血色素病HFE预防性换血治疗感基因携静脉血栓性梗凝血因子Ⅴ避免吸烟、口服避孕药带者塞基因(R506Q)

遗传性癌遗传性乳腺癌BRCA1、BRCA2监测、预防性手术切除

症易感基遗传性非息肉MLH1、MSH2

因肠癌(HNPCC)12预测性遗传筛查在个体的不同时期，针对不同对象进行新生儿筛查以便早诊断、治疗和预防育龄(婚前)对象筛查对发现严重疾病基团携带者进发病风险估计，防止遗传病发生在后代。产前筛查和产前诊断提供终止患病胎儿继续发育的选择。预植入基因诊断(PGD)，又称受精卵子宫着床前诊断，是针对体外授精、试管婴儿等辅助生殖技术的基因诊断。13第二节

基因诊断的常用技术和方法(一)基因诊断的常用技术

样品的核酸抽提目的序列的扩增（PCR)分子杂交

（Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、点杂交、ASO、原位杂交和DNA芯片技术）信号检测15TargetsandMolecularTechniquesDNASouthernblot,FISH,PCR,Sequencing,microarray,restrictionanalysis,RFLP，SSCPRNANorthernblot,RT-PCR,microarrays16BasicPrincipleDenatureHybridizeSouthern,FishPCRDNA:

denaturationandhybridizationofthehelixstructure17基本原理：核酸变性、复性复性RNADNA1.核酸分子杂交18核酸分子杂交的应用

研究DNA分子中特异基因的定位及检测确定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否基因芯片技术的基础19核酸分子杂交的流程示意图待测核酸制备滤膜上核酸固化杂交去除未参与杂交的探针检测杂交信号制备探针核酸片段探针标记加入标记核酸探针20探针（probe）探针：一段能与待测核酸片段互补结合、经过特殊标记的特异核苷酸序列。制备探针的方法：基因文库法、逆转录法、人工合成法等通常为单链核苷酸片段探针一般带有标记物21探针的种类基因组DNA

探针cDNA探针（应用最广泛）寡核苷酸探针(Oligonucleotideprobes)RNA探针22探针序列的选择致病微生物核酸中最保守、最特异的序列突变基因中含突变位点或突变区的序列待测基因编码的mRNA序列23探针的标记物放射性标记物（放射自显影）32P，35S，125I，3H非放射性标记物（化学显色）生物素，地高辛，荧光素，酶，金属24常用的固相核酸杂交的方法

Southern印迹杂交法(Southernblotting)Nouthern印迹杂交法(Nouthernblotting)

斑点杂交(dotblothybridization)或狭缝杂交法(slotblothybridization)

菌落杂交法(clonyhybridization)原位杂交法(nucleicacidhybridizationinsitu)25SouthernblotNNTTNTT26FISHN2728／原位杂交可检出被检基因的空间位置状况，即细胞的具体定位、数目及类型。29

2、聚合酶链反应体外基因扩增技术

（PolymeraseChainReaction，PCR）30基本原理变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C在体外不断进行DNA复制的过程31PCR技术的优点特异性强灵敏度高操作简单、省时对待检原始材料质量要求低高效率的基因扩增技术32PCR引物设计的一般原则引物的特异性（与非扩增区的同源性＜70%）引物长度（15-30bp）G+C含量（45%-55%）引物自身/之间不能形成二级结构3’3’5’5’5’5’33PCR的种类多重PCR(multiplexPCR）套式PCR（NestedPCR）PCR结合寡核苷酸探针斑点杂交法PCR-RFLP原位PCRRealtimePCR34PCR扩增产物分析法凝胶电泳PCR/点杂交PCR/SSCP（SingleStrandConformationPolymorphism）

PCR/sequencingPCR/RFLP35三、PCR扩增产物分析疑胶电泳分析法通过凝胶电泳检测扩增产物片段大小，若特异扩增出一条带，该法即可判断结果。注意平行对照：DNA分子量标准物阳性对照阴性对照内参照36限制性酶切分析法设计的引物，使扩增片段包括某一种或数个限制酶识别序列，PCR反应后用限制酶消化扩增产物，电泳检测酶切片段长度的变化。37

采用能与扩增产物内部核苷酸序列互补的寡核苷酸探针，实施斑点杂交或Southern印迹杂交当扩增产物出现多条带时，适用该法。核酸杂交法383.DNAsequencing最直接、最准确39DNA芯片技术

DNAchipsormicroarray40基因芯片技术的流程BiologicalSampleAnalyzedataScannermicroarray“Hybridize”arrayer

MicroarrayfabricationSamplepreparationMolecularhybridizationDetectionandanalysis41基因芯片打印仪42自动化4344单色荧光杂交结果Cye3Cye545双色荧光叠加结果46DNA序列分析基因突变检测及多态性分析基因表达谱分析基因诊断新药研发及药物筛选基因芯片基因芯片技术的应用47基因芯片技术的优势微型化和自动化高度平行性巨大的信息产出率高度敏感性和专一性强大的类比性48（二）基因诊断的基本方法基因突变的检测多态性分析基因表达异常的检测外源基因的检测49检测已知的点突变：

PCR/ASO探针法

ASO：等位基因特异性寡核苷酸检测未知的点突变：

PCR/SSCP/sequencingSSCP：单链构象多态性分析singlestrandconformationpolymorphism1.基因突变的检测50等位基因的特异寡核苷酸（ASO)探针

当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等基因特异的寡核苷酸探针，用同位素或非同位素标记进行诊断。探针通常为长20bp左右的核苷酸。用于探测点突变时一般需要合成两种探针，与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来.

51PCR/ASO探针法52通过PCR同时扩增待测基因和野生型对照基因的DNA片段，将扩增的双链DNA变性成单链，用非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。待测基因的单链DNA上单个碱基的改变可导致构象的改变，其电泳迁移率也会发生改变。通过比较这两者的迁移率，即可判断是否发生基因突变。PCR/单链构象多态性分析PCR/SSCP53正常人纯合突变杂合突变PCR/SSCP分析+—54PCR结合序列分析不仅可以检出有无突变，还能检测突变的具体位置和突变类型、获得碱基组成和顺序改变的详细信息。PCR/Sequencing552.多态性分析人群中不同个体间基因的核苷酸序列存在着差异性，称为DNA的多态性，是生物多样性的遗传基础。DNA多态性的发生可导致限制性内切酶识别位点的增加、缺失或易位，使DNA分子的限制性酶切位点数目、位置发生改变。用限制酶切割基因组时，所产生的限制性片段的数目和每个片段的长度就不同，即所谓限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,

RFLP）56RFLP分析法（1）限制性酶切图谱直接分析法（2）RFLP间接分析法

PCR/RFLP连锁分析法57限制性内切酶酶谱分析原理：某些疾病的发生是由于基因内单一碱基的改变引起，当此突变正好发生在限制性内切酶识别位点时，会导致内切酶图谱的改变，根据这一改变，综合其它因素，可对疾病的发生诊断。MSTII识别位点：

CCTNAGG正常

-珠蛋白基因：5’－CCTGAGG－3’镰刀型贫血：5’－CCTGTGG－3’实例分析：镰刀型红细胞性贫血58MMMMM正常－Hb镰刀型贫血－Hb1.1kb0.2kb1.3kbAAASSS1.3kb1.1kb0.2kb5960DNA重复序列多态性分析可变数目的串联重复序列（variablenumberoftandemrepeat,VNTR）：小卫星DNA；DNA指纹法短串联重复序列(shorttandemrepeat,STR):1~4bp，微卫星DNA数量多、分布均匀、易于检测613.基因表达异常的诊断mRNA的定量分析：点杂交、逆转录PCR法、竞争性PCRmRNA定性分析：Northern印迹法DNA芯片技术：通过一次杂交即可平行检测成千上万个基因的表达状况，从而在RNA诊断上具有显著的优越性。624.表观遗传学(epigenetic)DNA甲基化：DNA胞嘧啶(C)的第五位碳原子加上甲基(mC)

甲基化酶S-腺苷甲硫氨酸S-腺苷高半胱氨酸CH3胞嘧啶5-甲基化胞嘧啶CpG二联体基因组整体水平的甲基化检测基因特异位点甲基化的检测新甲基化位点的寻找。63三、基因诊断的应用

遗传疾病的基因诊断（产前、产后诊断）感染性疾病的基因诊断（早期诊断）肿瘤的基因诊断（分类分型与预后监测）基因诊断在法医学的应用（个体识别、亲子鉴定）判断个体疾病易感性器官移植组织配型64(一)遗传性疾病基因诊断直接基因诊断的前提是被检测基因必须已被克隆，基因的正常顺序和结构已被阐明，致病突变也已经清楚。直接诊断策略检测已知的致病基因较长的DNA片段的突变：Southernblot已知点突变：RFLP,PCR/ASO未知点突变：PCR/SSCP先寻找点突变，再用序列分析652.间接诊断策略：

检测与致病基因连锁的遗传标记限制性片段长度多态性、微卫星DNA序列和单核苷酸多态性（SNP)。寻找具有基因缺陷的染色体，并判断被检者是否具有这条染色体。(一)遗传性疾病基因诊断66(二)感染性疾病的基因诊断核酸分子杂交PCRDNA芯片技术外源基因的检测67(三)肿瘤的基因诊断1.肿瘤相关基因的检测（1）检测肿瘤相关基因的突变癌基因、抑癌基因、肿瘤转移基因、肿瘤转移抑制基因等（2）检测肿瘤相关病毒的基因①与鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤有关的EB病毒②与宫颈癌有关的人类乳头瘤病毒（HPV）③与肝癌有关的HBV、HCV

（3）检测肿瘤标志物基因2.肿瘤相关基因表达谱分析68肿瘤相关基因的检测p53基因突变的检测①PCR-SSCP法：可检测有无突变；②

PCR-sequencing：可检出有无突变，突变的密码子及突变、缺失或插入的碱基数及其部位；③PCR-RFLP法：可对突变后有酶切位点的消失或增加的突变进行检测。④p53寡核苷酸芯片69(四)基因诊断在法医学中的应用通过人类遗传基因分析来判断父母与子女是否亲生关系，称之为亲子鉴定。亲子鉴定方法

目前国内外进行亲子鉴定的试验手段主要有：①血型检验（人类白细胞抗原分型）②DNA多态性检验亲子鉴定70DNA指纹法（DNAfingerprints）提取人基因组DNA，用限制性内切酶切成不同长度的片段（各种VNTRs上都没有酶切位点），然后以VNTRs中的特异序列为探针进行Southern杂交，可发现阳性片段的长度各不相同。由于不同个体的这种串联重复的数目和位置都不相同，所以VNTRs的Southern杂交带谱就具有高度的个体特异性，称其为DNA指纹，可用于亲子鉴定、法医鉴定等。71在亲子鉴定中，小孩的DNA指纹均可在父亲或母亲指纹中找到相同位置的条纹，(用黑点虚线表示)，由此可看出，子代的DNA指纹均来自父亲和母亲的DNA指纹，而他人的指纹、与小孩的指纹无一相符。亲子鉴定72DNA指纹分析法①一个DNA指纹探针可同时检测十几个，甚至几十个位点的变异，因而DNA指纹更能反映基因组的特异性；②