15章-干细胞-杨课件

Stemcell

干细胞2013-121干细胞的定义及特点一类具有自我更新与分化潜能的未分化或低分化细胞。干细胞具有“无限”的增殖能力，能够产生与母代细胞完全相同的子代细胞，维持该干细胞种群。

自我更新多分化潜能（可塑性）

干细胞能分化生成不同表型的成熟细胞，例如胚胎干细胞可以分化形成个体的所有成熟细胞类型。干细胞分化常发生在病理情况下，向病理部位迁移，成为病理部位的前体细胞，并分化为终末成熟细胞，因此不仅可以修复组织的损伤，而且可以作为细胞替代治疗和‘基因治疗’的理想载体。化学趋向性干细胞系的获得不但为生物基础领域的研究提供了重要工具，而且使现代医学领域应用干细胞移植治疗各种难治性疾病成为可能，这意味着干细胞医学将产生巨大的发展潜力和应用前景。干细胞与医学

根据细胞分化潜能不同，分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞（unipotentstemcells）。(二)干细胞的分类

根据细胞所处的发育阶段和发生学来源的不同，分为胚胎干细胞和成体干细胞（包括组织干细胞和生殖干细胞）。①胚胎干细胞(embryonicstemcell)：受精胚胎囊胚期的内细胞团、胎儿原始生殖嵴、重构胚的囊胚期细胞②成体干细胞(somaticstemcell)：干细胞分化时，干细胞的独特增殖方式：干细胞具有独特的增殖方式，即不对称分裂（asymmetricdivision）。干细胞通过非对称分裂产生与一个与母代细胞完全相同的子代细胞，以保持干细胞稳定；同时还产生过渡放大细胞（TA细胞），再由过渡放大细胞经过若干次分裂，最终产生分化细胞。

概念：个体出生以后，组织干细胞（包括生殖干细胞）生活的特殊微环境称为干细胞微环境，这个微环境对干细胞的增殖与分化起着严密的调控作用，又称为干细胞巢（stemcellniche）。不同组织类型的“干细胞微环境”的组成及定位不同。五、干细胞生理活动的微环境是干细胞维持自我更新和分化潜能的重要场所

干细胞需要特殊的微环境才能执行正常的生理功能。如果将造血干细胞从其正常生存的微环境中分离，它们即丧失了自我更新的能力。（一）干细胞需要特殊的微环境才能执行正常的生理功能

微环境还能调控干细胞的分化发育方向，例如，在不同信号途径构成的微环境中，干细胞能向不同的谱系细胞分化。

果蝇卵巢干细胞微环境果蝇卵巢干细胞微环境成年果蝇卵巢生殖干细胞（germlinestemcell，GSC）位于卵巢原卵区的顶部，并被三种不同的基质细胞群所包绕：端丝(terminalfilament)、帽细胞(capcell)以及内鞘细胞（innersheathcell）。这三种基质细胞以及基膜共同构成GSC微环境，其中帽细胞通过E-cadherin介导的紧密连接将GSC固定在微环境中，与其他基质细胞产生的细胞信号分子如BMP、Notch等共同调控GSC的生长和分化。（二）干细胞微环境包括多种组成成分信号分子:以自分泌或旁分泌的形式影响干细胞的增殖与分化。细胞黏附分子:确保干细胞定居于微环境中，并接受信号分子的调节。细胞外基质:对干细胞正常功能的维持提供了重要信号，并且可以直接调节干细胞的分化方向。空间效应:空间结构对保持适宜的干细胞数目和干细胞的定向分化发挥了重要作用。

干细胞微环境是由定位于组织内的一群特殊细胞和细胞外支持结构组成（三）干细胞微环境具有一些共同的结构与功能特点

一些重要的信号分子辅助干细胞定位于微环境

干细胞微环境能够产生多种外源信号分子，调控干细胞分化及增殖

脊椎动物和哺乳动物干细胞微环境具有特定的结构骨髓干细胞微环境胚胎干细胞特征性的基因产物和表面标记分子：特征性基因产物如SSEA-3，SSEA-4,TRA-1-60，TRA-1-81,碱性磷酸酶等整合素如整合素α6和β1，连接蛋白43等转录因子如Oct3/4，Nanog，Sox2等人类ES细胞与小鼠ES细胞的比较人类ES细胞小鼠ES细胞形态扁平的、有明显细胞边界的克隆

紧密聚集型，形成圆顶样克隆

分化差异体外培养条件下较容易分化，并形成多种原始干细胞和部分处于不同分化阶段幼稚细胞的多克隆

体外培养条件下较容易分化培养条件加入细胞因子LIF不能完全替代饲养细胞的作用细胞因子LIF不能完全替代饲养细胞的作用组织干细胞和多能干细胞用圆形表示，分化细胞用方形表示。

造血干细胞造血干细胞（HSC）的分化是典型的等级式分化过程，HSC首先分化形成多能造血祖细胞，然后分化为髓系干细胞和淋巴系干细胞，髓系干细胞分化形成红细胞、血小板、巨噬细胞、中性粒细胞，而淋巴系细胞则形成T细胞，B细胞，NK细胞等。

间充质干细胞的体外诱导分化

MSC的应用

MSC局部移植治疗组织器官的系统移植干细胞的基因治疗组织工程中MSC的应用器官移植的排斥反应中起免疫调节作用

神经干细胞的发现1992年BrentA.Reynolds和SamuelWeiss从成年小鼠侧脑室膜下区分离出能够不断增殖并具有分化潜能的细胞。

神经干细胞的特征性表面标志物包括神经细胞中间丝蛋白，即巢蛋白（nestin），以及波形蛋白（vimentin）、胶质细胞原纤维酸性蛋白（GFAP）等。皮肤毛囊干细胞、肝和小肠干细胞的定位及分化调控皮肤干细胞表皮干细胞毛囊干细胞、毛囊黑素干细胞真皮中分离的间充质干细胞皮肤表皮干细胞的表面标志物

整合素运铁蛋白受体（transferrinreceptor）角蛋白（Keratin，CK）c-Myc和p63

小肠干细胞位于小肠隐窝底部，分散于潘氏细胞周围，隐窝干细胞的数目约占0.4%～0.6%，每一个隐窝大约包括了4～6个小肠干细胞。

肝干细胞的特征性标志物肝干细胞角蛋白19（CK19）神经细胞黏附分子（NCAM）上皮细胞黏附分子（EpCAM）claudin-3(CLDN-3)Liv2、Dlk-2肝祖细胞甲胎蛋白（AFP）Alb基因

成体肝组织内分离得到具有向肝细胞和胆管上皮细胞双向分化特性的肝干细胞。体外胚胎干细胞向肝细胞的定向诱导分化：主要经过胚状体形成—内胚层特定分化—肝祖细胞形成—类肝细胞成熟四阶段形成肝样细胞。起源于卵黄囊内胚层细胞,位于卵黄囊的前尾区。在不断分裂增殖的过程中迁徙至尿生殖嵴,以后发育为精原细胞。原始生殖细胞的来源多数观点认为其来源于胚胎外胚层，但人类原始生殖细胞可能起源于靠近尿囊基部的卵黄囊背侧内胚层。原始生殖细胞的来源多数观点认为其来源于胚胎外胚层，但人类原始生殖细胞可能起源于靠近尿囊基部的卵黄囊背侧内胚层。

生殖干细胞维持了生物种代间的延续性胚胎来源的胚胎生殖细胞成体组织来源的生殖干细胞生殖干细胞生殖干细胞是形成成熟配子体（精子或卵子）的前体细胞，通常认为其起源于原始生殖细胞(primordialgermcell，PGC)。原始生殖细胞具有特征性的表面标志物人类原始生殖细胞高表达碱性磷酸酶、糖脂类SSEAs、糖蛋白TRA-1-60、TRA-1-81、EMA-1、转录因子OCT-4及端粒末端转移酶（hTERT）。

PGC的分化需要BMP和转化生长因子超家族成员的协同作用。是从肿瘤组织中分离或鉴定的少数细胞，具有无限的自我更新和诱导肿瘤发生的能力，是肿瘤产生的种子细胞。

1994年JohnDick首先发现急性髓样白血病（AML）病人体内存在肿瘤干细胞。2003年发现了乳腺癌干细胞和脑肿瘤干细胞。目前已经在肠道肿瘤、骨肉瘤、肝癌等实体瘤以及血液系统肿瘤中发现了肿瘤干细胞。肿瘤干细胞的发现肿瘤干细胞与正常干细胞的比较

具有一些共同的表面标志物均具有体内组织器官的迁移能力均具有强大的自我更新能力存在相似的、调节自我更新的信号转导途径。

肿瘤干细胞的生物学特征图已经鉴定的肿瘤干细胞表面标志物肿瘤类别细胞表面标志物AMLCD34+CD38-多发性骨髓瘤CD34-CD138-神经系统肿瘤CD133+乳腺癌CD44+CD24-/low结肠癌CD133+肝癌CD90+CD45-胰腺癌CD44+CD24+ESA+头颈部肿瘤CD44+Lineage-基因突变与“克隆进化”假说不能完全解释肿瘤的发生机制

体细胞自发突变形成肿瘤的可能性比较小。肿瘤的发生必须突破细胞静止状态的限制，例如逃逸一些调控细胞周期关键分子的作用。干细胞强大的增殖能力可以作为肿瘤细胞的重要来源，同时它们在体内长期存在，也为基因的突变积累提供了基础。干细胞异常分化与肿瘤的发生

肿瘤的发生是一种克隆进化疾病。

肿瘤的发生是体细胞基因多阶段突变积累和演变的过程，经历了起始（initiation）、积累（accumulation）和促进（promotion）三个阶段。

结肠癌的发生是典型的、研究较为透彻的基因突变积累过程的例子。

肿瘤发生的克隆选择假说与肿瘤干细胞假说瘤肿瘤干细胞微环境与肿瘤干细胞恶性转化肿瘤干细胞微环境图肿瘤干细胞微环境中的信号异常活化或者结构改变，是肿瘤干细胞恶性表型的重要刺激因素（小肠腺瘤细胞、皮肤毛囊肿瘤细胞和淋巴细胞性白血病细胞信号通路的异常）细胞治疗（celltherapy）

将体外培养的、具有正常功能细胞植入病人体内（或直接导入病变部位），以代偿病变细胞所丧失的功能。或采用基因工程技术，将所培养的细胞在体外进行遗传修饰后，再将其用于疾病的治疗。

细胞治疗示意图

MouseembryonicstemcellsinjectedintoratbrainsexpresstheAHD2proteinmarker(yellow)characteristicofcellslostinParkinson'sdisease.神经干细胞(red)用于颅内肿瘤(green)的治疗心血管内科内分泌内科神经内科肿瘤内科免疫内科心血管病急性心肌梗塞缺血性心脏疾病心力衰竭糖尿病肌营养失调帕金森氏症老年痴呆症共济失调脊髓外伤性瘫痪运动神经元病重症肌无力急性白血病慢性髓性白血病恶性淋巴瘤多发性骨髓瘤慢性淋巴性白血病骨髓增生异常综合征化疗后的支持疗法遗传性免疫缺陷病获得性免疫缺陷综合征风湿性关节炎克隆氏病复发性硬化心脏外科血管外科神经外科骨科整形科外周血管病糖尿病足闭塞性脉管炎血栓脊髓损伤肌萎缩性脊髓侧索硬化症脑外伤后遗症脑梗死植物人脑卒中后遗症脊髓炎后遗症骨折股骨头坏死骨质疏松症脑外伤腰椎骨折骨折不愈合去皱美容凹陷性疤痕抗衰老消化内科妇儿科眼科五官科其它肝炎肝硬化小儿脑瘫视神经发育不良及萎缩口腔科（外）牙病艾滋病等细胞工程细胞规模化培养：蛋白表达、抗体制备细胞融合：单克隆抗体制备、肿瘤疫苗核移植：克隆动物、转基因动物细胞基因转移：工程化细胞、生物工程药物、疫苗制备、细胞模型单克隆抗体制备（invitrofertilizationandembryotransfer,IVF-ET）即试管婴儿。1978年世界上第一例试管婴儿1988年我国第一例试管婴儿

体外受精与胚胎移植在不孕不育方面的运用

试管婴儿的培育技术已经走过了三代，其主要差别是在受精卵“制造”上。第一代：把精子和卵子直接放在一起，增加两者相遇机会。第二代：将单个精子直接注射入卵子里，从而“制造”出受精卵、胚胎，它适用于男方少精、弱精、甚至无精的情况。IVF-ET技术的发展

第三代：与第二代相近，只是要对卵裂球进行“胚胎种植前的遗传学诊断”，挑选出无遗传性疾病基因的胚胎移植入母体子宫，它适用于患有某种遗传性疾病的夫妻。

例如有一位母亲是血友病基因的携带者，她自己虽然不发病，但是，她的两个儿子都是血友病患者，接连不幸夭折。这位悲伤的母亲来到试管婴儿中心，要求给她做试管婴儿。医生考虑到她的情况，决定给她做“第三代”试管婴儿。IVF-ET的主要过程药物诱发排卵B超监测取卵精样准备体外受精胚胎移植结果监测精子库、卵子库与胚胎库等应运而生不良后果：血亲婚配、名人精子效应、代孕噱头等克隆能给人类带来什么克隆动物是未来的制药厂克隆的爱因斯坦会懂“相对论”吗？概念：是指应用工程学和生物学的原理和方法来研究正常或病理状况下哺乳动物组织的结构、功能和生长的机理，进而开发能够修复、维持或改善损伤组织的人工生物替代物的一门学科。

组织工程的一般方法：大规模扩增从体内获得的细胞在聚合物骨架上种植这些细胞细胞增殖、分化，形成具有特定形态和功能的工程组织组织工程的基本方法

组织工程皮肤的支架组织工程皮肤组织工程膀胱（artificialbladder）ArtificialbladderbeingdevelopedbyJamesJ.YooM.D.,Ph.D.attheDepartmentofUrologyatHarvardMedicalSchool.小肠粘膜下组织（smallintestinesubmucosa，SIS）和膀胱无细胞基质（bladderacellularmatrix，BAM）是两种新型的组织工程膀胱替代材料，取自猪的小肠粘膜下基质组织，经脱细胞、去免疫处理制备而成，目前已经商品化（OaSIS™）。干细胞研究的伦理学问题干细胞与医学

成人：知情和自愿原则成体干细胞来源禁止从人胚胎中获取多能干细胞禁止将人类多能干细胞用于制作或构建人胚胎禁止以获取多能干细胞进行研究为目的，通过体外受精制作人胚胎禁止通过体细胞核移植的方法获得的人类多能干细胞进行研究禁止将人类多能干细胞研究与体细胞核移植研究结合用于制作克隆人的研究活动NIH关于胚胎性干细胞研究的指导原则诱导性多能干细胞（inducedpluripotentstemcellsiPS）：2006年日本京都大学ShinyaYamanaka在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究。他们把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似iPS细胞具有和胚胎干细胞相似的生物学特征

1.细胞