数字聚合酶链反应分析仪校准规范

JJF2055—20231数字聚合酶链反应分析仪校准规范1范围本规范适用于微滴式、芯片式和微孔式数字PCR(PloymeraseChainReaction)仪计量性能的校准,对于其他类型的数字PCR仪,可参照本规范执行。2引用文件本规范引用了下列文件:JJF1527聚合酶链反应分析仪校准规范YY/T1173聚合酶链反应分析仪ISO20395:2019生物技术—核酸靶序列定量方法的性能评价要求—qPCR法和dPCR法(Biotechnology—Requirementsforevaluatingtheperformanceofquantificationmethodsfornucleicacidtargetsequences—qPCRanddPCR)凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本规范;凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本规范。3术语和计量单位3.1数字PCRdigitalPCR,dPCR将核酸模板分布在多个等体积的反应单元,每个反应单元中包含或不包含一个或多个拷贝的靶序列(核酸模板),对靶序列进行PCR扩增,并对特定的PCR产物进行检测,再根据阳性微滴的比例以及泊松分布原理,计算出靶序列的浓度或拷贝数。注1:假设在分割过程中,核酸靶序列是随机且独立地分布在各个反应单元中。dPCR平台可以对PCR产物进行实时qPCR监测。[ISO20395:2019,3.10]3.2数字PCR仪digitalPCRanalyzer基于PCR技术原理,模拟DNA或RNA复制过程,在核酸模板、引物、聚合酶等存在的条件下,将核酸模板分布在多个反应单元中,特异扩增已知序列,对扩增后的荧光信号进行检测分析的仪器设备。3.3拷贝数copiesnumber包含特定核酸序列的分子数。[ISO20395:2019,3.6]3.4拷贝数浓度copiesnumberconcentration[ISO20395:2019,3.7]单位体积中包含特定核酸序列的分子数。注:以copies/μL为计量单位。JJF2055—202324概述数字PCR仪(以下简称dPCR仪)是通过微流控技术将核酸样本与PCR反应试剂混合液分布在多个反应单元内,进行PCR扩增,通过荧光检测器读取扩增后每个反应单元的荧光信号强度来判断含有目标核酸分子(阳性反应)的单元的个数(P),基于泊松分布,根据反应单元的个数(N)、每个反应单元的体积(VP)以及稀释因子(D),可计算出样本中的核酸分子数,从而实现对核酸拷贝数浓度(T)的绝对测量[见公式(1)]。微滴式dPCR仪由微滴生成仪、PCR扩增仪、微滴阅读器3部分组成。芯片式和微孔式dPCR仪由加样器、热循环/检测器两部分或加样器、PCR扩增仪和芯片阅读器3部分组成。核酸拷贝数浓度按公式(1)计算:T×ln1-(1)式中:T—核酸拷贝数浓度,copies/μL;D—稀释因子;VP—每个反应单元的体积,μL;P—含有目标核酸分子(阳性反应)的反应单元的个数;N—反应单元的个数。5计量特性计量特性见表1中的规定。表1dPCR仪计量特性及指标序号计量特性计量特性指标1温度示值误差±1.0℃2温度均匀度≤2.0℃3升温速率(50~90)℃≥0.8℃/s4降温速率(90~50)℃≥0.8℃/s5拷贝数浓度示值相对误差±30%6拷贝数浓度重复性≤10%7荧光强度重复性≤10%8反应单元数重复性≤30%注:对于芯片式数字PCR荧光强度重复性、反应单元数重复性不做校准。以上指标不用于合格判别,仅供参考。JJF2055—20233扩展不确定度扩展不确定度≤8%(k=2)满足校准需求。6校准条件6.1环境条件6.1.1环境温度为(15~30)℃,相对湿度不大于80%。6.1.2实验室环境应满足仪器安装的要求,不得存在强烈的机械振动和电磁干扰。注:上述条件与制造商的产品规定不一致时,以产品规定为准。6.2测量标准及其他设备6.2.1标准物质:校准时应采用经计量行政部门批准发布的、非单一数字PCR原理的方法定值的DNA拷贝数浓度标准物质。其特性量值拷贝数浓度>104copies/μL,相对6.2.2荧光强度重复性校准溶液:羧基荧光素(FAM)通道校准荧光溶液激发波长范围为450nm~495nm,发射波长范围为515nm~530nm,六氯荧光素(HEX/VIC)通道校准荧光溶液激发波长范围为515nm~535nm,发射波长范围为550nm~580nm。校准前按照附录A配制校准时使用的溶液。6.2.3PCR引物和探针序列:本规范推荐使用与6.2.1标准物质匹配的引物和探针序列。6.2.4温度校准装置:由若干个(通常为15个、12个、5个)精密温度传感器、数据采集分析模块组成,测温范围为(0~120)℃,温度校准装置测量不确定度≤0.1℃6.2.5移液器:规格为10μL、100μL、6.2.5移液器:规格为10μL、100μL、200μL、1000μL。6.2.6超纯水:电阻率≥18.2MΩ·cm(25℃)。7校准项目和校准方法7.1校准条件校准前需将dPCR仪开机预热30min,确保仪器达到正常工作状态。7.2温度示值误差、温度均匀性校准7.2.1将dPCR仪及温度校准装置各部件连接完好,在温度传感器表面上涂抹适量导热油,依据dPCR仪器型号和加热模块形状不同,按图1、图2、图3所示将温度传感器置于dPCR仪加热模块设定位置(孔),其中图1为15个独立的测温探头(A1、A4、A7、A10、A12、D1、D7、D12、E4、E10、H1、H4、H7、H10、H12),图2为12个独立的测温探头(A1~A4、B1~B4、C1~C4),图3为5个独立的测温探头(A、B、C、D、E)。其他型号的dPCR仪可参照图1、2、3排布进行校准。JJF2055—20234图196孔加热模块温度传感器排布示意图图212个平板加热模块温度传感器排布示意图图3单个平板加热模块温度传感器排布示意图JJF2055—202357.2.2参照送校单位提供的dPCR仪说明书设定温度控制程序,如表2所示(如不能设置30℃,温控程序参考表2执行)。表2dPCR仪温度控制程序标准程序表步骤设定温度点/℃设定温度持续时间/min130129533302490355036703760383017.2.3启动温度校准装置,记录整个数据采集过程并保存。7.2.4温度示值误差校准结果按公式(2)和公式(3)计算:ΔTd=Ts-Tc(2)Tc=Ti(3)式中:ΔTd—温控装置工作区域内温度示值误差,℃;Ts—温控装置工作区域内设定温度值,℃; Tc—所有测温传感器测量值的平均值,℃;Ti—设定温度点,稳定时间不少于10s期间的第i个温度传感器记录值,℃。7.2.5温度均匀度校准结果按公式(4)计算:式中:ΔTu—温度均匀度,式中:ΔTu—温度均匀度,℃;Tmax—所有测温传感器测定值的最大值,℃;Tmin—所有测温传感器测定值的最小值,℃。7.3升降温速率校准7.3.1参照送校单位提供的dPCR仪说明书设定该dPCR仪的温度控制程序,如表3所示。启动温度校准装置,记录整个数据采集过程并保存。表3dPCR仪温度控制程序标准程序表步骤设定温度点/℃设定温度持续时间/min145329533453JJF2055—202367.3.2记录仪器显示温度达到设定温度恒温10s后,取50℃温度点,温度记为TA,取90℃温度点,温度记为TB,从TA到达TB的时间记为t,按图4所示模式取点计算平均升温速率。图4升降温速率计算模式按公式(5)计算平均升温速率:(5)VUT(5)式中:VUT—平均升温速率,℃/s;TA—50℃温度点测量值,℃;TB—90℃温度点测量值,℃;t—从TA到达TB的时间,s。7.3.3平均降温速率校准取90℃温度点,温度记为TA,取50℃温度点,温度记为TB,从TA到达TB的时间记为t,按图4所示模式取点计算平均降温速率。按公式(6)计算平均降温速率:VDT(6)式中:VDT—平均降温速率,℃/s;TA—90℃温度点测量值,℃;TB—50℃温度点测量值,℃;t—从TA到达TB的时间,s。7.4拷贝数浓度示值相对误差校准拷贝数浓度示值相对误差校准用标准物质和荧光溶液的配制方法见附录A。用经过计量校准的移液器,将配制好的PCR反应体系加入反应板中,依据dPCR仪器型号和PCR反应发生的形式不同,按表4所示准备校准板,其他型号的仪器可参照本示例准备。dPCR反应体系的配制方法见附录B。JJF2055—20237表496孔板校准板排布孔位12ASF-HBSF-HCSF-HDSF-HESF-HFSF-HGNTCNTCHNTCNTC注:S为拷贝数浓度标准物质;F-H为适用于FAM和VIC通道荧光强度重复性校准的荧光溶液;NTC为无核酸模板的空白对照,NTC的结果不大于0copies/μL。其他类型的仪器可参考此排布。参照送校单位提供的dPCR仪说明书设定该dPCR仪的温度控制程序,如表5所示。表5dPCR仪的温度控制程序表温度/℃时间循环数9510min19430s40581min98*10min1*此步骤仅用于微滴式dPCR仪96孔板扩增时的PCR程序。参照送校单位提供的dPCR仪说明书设定dPCR仪的数据分析参数。选择校准板中为S的孔,记录其拷贝数浓度值,按公式(7)计算拷贝数浓度示值相对误差。ΔC×100%(7)式中:ΔC—示值相对误差;C—仪器测量平均值,copies/μL;CS—标准物质标称值,copies/μL。7.5拷贝数浓度重复性校准选择校准板中标记为S的孔,记录其拷贝数浓度值,按公式(8)计算拷贝数浓度JJF2055—20238重复性RSD拷贝数。 RSD拷贝数=(ix)2××100%(8)式中:RSD拷贝数—拷贝数浓度相对标准偏差;xi—第i次S拷贝数浓度的测定值,copies/μL;x—6次S拷贝数浓度的平均值,copies/μL。7.6荧光强度重复性选择校准板中标记为F-H的孔,分别记录其FAM和VIC通道的荧光强度值,根据公式(9)分别计算FAM和VIC通道荧光强度重复性RSD荧光强度。 RSD荧光强度=(6F-iF)2××100%(9)式中:RSD荧光强度—相对标准偏差;Fi—第i次荧光强度的测定值;F—6次荧光强度的平均值。7.7反应单元个数重复性选择校准板中标记为S的孔,记录其读取的反应单元的个数,按公式(10)计算反应单元个数重复性RSD反应单元个数。 RSD反应单元个数=(iN)2××100%(10)式中:RSD反应单元个数—反应单元个数相对标准偏差;Ni—第i次读取的反应单元的个数;N—6次读取的反应单元的平均值。8校准结果表达8.1校准结果处理经校准后的dPCR仪应填发校准证书,校准证书应符合JJF1071—2010中5.12的要求,并给出各校准项目名称和测量结果以及扩展不确定度。校准原始记录格式见附录C。8.2校准证书经校准的dPCR仪应出具校准证书。校准证书应包括的信息及推荐的校准证书的内页格式见附录D。当用户要求时,可以根据用户提供的计量特性的最大最大允许误差进行符合性判定,并将结论列入校准证书。JJF2055—202398.3校准结果的测量不确定度dPCR仪校准结果的不确定度按JJF1059.1—2012的要求评定,拷贝数浓度示值相对误差和温度示值误差的不确定度及评定示例见附录E和附录F。9复校时间间隔复校时间间隔由仪器质量和使用频次、年限等因素决定,用户根据实际情况,自行确定仪器复校时间间隔,建议不超过1年。JJF2055—202310附录A标准物质和荧光溶液配制及使用10mmol/L的Tris-HCl+0.1mmol/L的EDTA缓冲液(TE0.1)溶液的配制方法:EDT11液器将1mL的1mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH=EDT11液器将标准物质稀释至合适的浓度,浓度根据被校准的dPCR仪反应单元数确定,使每个反应单元的核酸拷贝数接近1.59。荧光溶液标准物质的配制方法:具体的配制方法见表A.1。校准时,取按照表A.1配制好的荧光溶液标准物质50μL,取6-HEX亚磷酰胺溶液标准物质50μL,至同一离心管内,混匀、瞬时离心后备用。其他荧光溶液试剂的配制方法可参照此表。表A.1荧光溶液标准物质的配制方法步骤荧光溶液标准物质6-HEX亚磷酰胺溶液标准物质1称量荧光素固体(纯度95%以上)2.19mg称量6-HEX亚磷酰胺固体(纯度93%以上)4.4mg2加入1076μL乙醇,溶解得到母液A加入1056μL乙腈,溶解得到母液A3取200μL母液A,加ddH2O23800μL,混匀得到母液B取600μL母液A,加ddH2O11400μL,混匀得到6-HEX亚磷酰胺标准物质溶液4取200μL母液B,加ddH2O24800μL,混匀得到荧光标准物质溶液—JJF2055—202311附录B反应体系的配制dPCR仪反应体系配制见表B.1。表B.1dPCR反应体系配制表PCR反应试剂使用浓度体积/μL微孔式dPCR微滴式dPCR芯片式dPCR12×76548×7702×PCR预混液1×101052.520×加样缓冲液1×—00.50.25F/R/P*20×110.50.25DNA拷贝数浓度标准物质—4421ddH2O—5521*F为正向引物,R为反向引物,P为探针,校准时根据使用的标准物质选择匹配的引物和探针序列。标准物质量值如采用同位素稀释质谱或其他方法定值,其直接测量浓度(c2)单位为ng/μL,应根据标准物质的相对分子质量换算为拷贝数浓度(c1),换算公式如下,其中M为DNA标准物质的相对分子质量。c1=c2×109×6.02×1023MJJF2055—202312附录C校准原始记录参考格式送检单位:校准日期:年月日仪器名称:制造厂:型号:出厂编号:证书编号:环境温度:℃相对湿度:%气压:kPa1.温度示值误差和温度均匀度设定温度℃A1A4A7A10A12D1D7D12E4E10H1H4H7H10H1230.050.060.070.090.095.02.平均升温速率A均降温速,TB=℃,t=s。4.拷贝数浓度示值相对误差和重复性TA=℃,TB=℃,t=4.拷贝数浓度示值相对误差和重复性项目S测量值/(copies/μL)平均值/(copies/μL)示值相对误差重复性5.荧光强度重复性荧光强度测量值重复性FAMVICJJF2055—2023136.反应单元个数重复性微滴/微孔个数测量值重复性校准员:核验员:JJF2055—202314附录D校准证书(内页)参考格式1.温度示值误差设定温度℃Tc℃ΔTd℃不确定度℃(k=2)℃30.050.060.070.090.095.02.温度均匀度设定温度/℃极差/℃30.050.060.070.090.095.03.平均升温速率UD贝数值相对误差与重复性项目标准值copies/μL测量值copies/μL示值相对误差%重复性%不确定度(k=2)S1JJF2055—2023156.荧光强度重复性FAM荧光强度重复性:VIC荧光强度重复性:7.反应单元个数重复性校准员:核验员:JJF2055—202316附录E拷贝数浓度示值相对误差的不确定度评定示例E.1测量方法采用dPCR仪直接测定稀释到一定浓度的标准物质的拷贝数浓度,并与稀释后的标准物质的标准值比较。E.2测量模型 ΔC×100%式中:ΔC—示值相对误差;C—仪器测量平均值,copies/L;Cs—稀释后的标准物质标称值,copies/L。E.3不确定度传播定律 u2(ΔC)=2u2(C)+2u2(Cs)E.4不确定度评定E.4.1不确定度来源输入量C的不确定度来源主要是由测量重复性引入的不确定度;输入量Cs的不确定度来源主要是由配制的标准物质引入的不确定度。E.4.2测量重复性引入的不确定度分量u(C)对稀释到5000copies/μL的DNA定量标准物质进行10次重复测量,10次重复测量的结果见表E.1。表E.1DNA定量标准物质的测量结果重复测量次数12345678910测量结果copies/μL5037496652965154513951794819493548494824C=Ci/n=5020copies/μL,n=10则单次测量结果的实验标准差s(C)为:s(C)=(Ci-C)2/(n-1)=167copies/μL,n=10JJF2055—202317实际校准时在重复性条件下连续测量6次,以6次测量的算术平均值作为结果,则由测量重复性引入的标准不确定度为:u(C)68copies/μL,n=6E.4.3由标准物质溶液引入的不确定度分量u(Cs)配制标准物质溶液的不确定度来源有:标准物质引入的不确定度和稀释引入的不确定度。E.4.3.1标准物质引入的不确定度分量urel(CRM)104c标1定度(k=2)为0.35×uCRM1.75×103copies/μLurel(CRM)=..=2.8%E.4.3.2标准溶液稀释引入的不确定度分量urel(D)将标准值为6.18×104copies/μL的标准物质溶液稀释得到5×103copies/μL的溶液。稀释时分别使用10μL的移液器移取标准物质溶液10μL,200μL的移液器移取112μLTE0.1溶液。20℃时,10μL的移液器标称容量的最大允许误差为±8.0%,按均匀分布:urel(D11)4.6%移液器校准时的温度为20℃,配制溶液时温度变化范围为±2℃,水的体积膨胀系数为2.1×10-4/℃,由温度效应产生的体积变化为±(10×2×2.1×10-4)=±0.0042μL。按均匀分布,包含因子为k=3。由此引入的相对不确定度urel(D12)为:urel(D12)0.024%合成相对不确定度为:20℃时,200μL的移液器标称容量的最大允许误差为±2.0%,按均匀分布:urel(D1)=uel20℃时,200μL的移液器标称容量的最大允许误差为±2.0%,按均匀分布:urel(D21)1.2%移液器校准时的温度为20℃,配制溶液时温度变化范围为±2℃,水的体积膨胀系数为2.1×10-4/℃,由温度效应产生的体积变化为±(112×2×2.1×10-4)=24。按均匀分布,包含因子为k=3。由此引入的标准不确定度urelurel(D22)=.2μL=0.024%合成相对不确定度为:JJF2055—202318稀释((1.2%)2+(0.024%)2=1.2%E.4.3.3由标准物质溶液引入的相对标准不确定度urel(Cs)urel(D)=uel(D1)+uel(D2)=(4.6%)E.4.3.3由标准物质溶液引入的相对标准不确定度urel(Cs)E.4.3.4由标准物质溶液引入的标准不确定度u(Cs)urel(Cs)=uel(CRM)+uel(D)=(2.8%)2E.4.3.4由标准物质溶液引入的标准不确定度u(Cs)u(Cs)×Cs=5.6%×5000copies/μL=280copies/μLE.4.4标准不确定度一览表标准不确定度一览表见表E.2。表E.2拷贝数浓度示值相对误差校准标准不确定度一览表标准不确定度符号不确定度来源标准不确定度copies/μL u(C) 测量重复性68u(Cs)标准物质280E.4.5合成标准不确定度uc(ΔC)=2u2(C)+2u2(Cs)=2×682+2×2802=5.8%E.4.6扩展不确定度U=k×uc(ΔC)=11.6%取包含因子k=U=k×uc(ΔC