分子生物学常用技术

关于分子生物学常用技术分子生物学常用技术凝胶电泳分子杂交聚合酶链反应(PCR)技术DNA的物理图谱DNA序列测定基因芯片第2页,共130页，2024年2月25日，星期天第一节凝胶电泳

(gelelectrophoresis)电泳概念基本原理Qμ＝

6πrη

μ:迁移率

Q:电荷量

r:粒子半径（分子量）η:介质粘度

第3页,共130页，2024年2月25日，星期天电泳的用途分离鉴定纯度测定分子量凝胶电泳的种类琼脂糖凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳

第4页,共130页，2024年2月25日，星期天一、琼脂糖凝胶电泳

(agarosegelelectrophoresis)

分离核酸原理操作要点应用范围第5页,共130页，2024年2月25日，星期天（一）分离核酸原理

电荷效应

分子筛效应

分子构象第6页,共130页，2024年2月25日，星期天1.电荷效应核酸是两性电解质

pH=3.5,正电荷pH=8.0~8.3

,负电荷，正极第7页,共130页，2024年2月25日，星期天第8页,共130页，2024年2月25日，星期天2.分子筛效应小分子移动快，大分子移动慢第9页,共130页，2024年2月25日，星期天3.分子构象闭环超螺旋>线状DNA>开环DNA

+-第10页,共130页，2024年2月25日，星期天（二）操作要点支持物凝胶浓度的选择

DNA分子量标准电泳缓冲液样品制备电泳条件

DNA电泳染色

DNA片段的回收第11页,共130页，2024年2月25日，星期天1.支持物第12页,共130页，2024年2月25日，星期天商品化的琼脂糖第13页,共130页，2024年2月25日，星期天琼脂糖种类普通低熔点高纯高筛分熔点80~90℃<70℃80~90℃80~90℃机械强度中差高高分辨率中差中高第14页,共130页，2024年2月25日，星期天2.凝胶浓度的选择第15页,共130页，2024年2月25日，星期天凝胶的制备第16页,共130页，2024年2月25日，星期天第17页,共130页，2024年2月25日，星期天第18页,共130页，2024年2月25日，星期天3.DNAmarker第19页,共130页，2024年2月25日，星期天DNAmarker第20页,共130页，2024年2月25日，星期天DNA长度标准曲线第21页,共130页，2024年2月25日，星期天4.电泳缓冲液

Tris-乙酸(TAE)pH8.0

Tris-硼酸(TBE)

pH8.0

Tris-磷酸(TPE)pH8.0

第22页,共130页，2024年2月25日，星期天5.样品制备上样缓冲液50%甘油/蔗糖0.5%溴酚蓝/二甲苯青

第23页,共130页，2024年2月25日，星期天点样第24页,共130页，2024年2月25日，星期天6.电泳条件潜水电泳恒压电泳

低压:1~2V/cm

中压:8~10V/cm

高压电泳：>几十V/cm温度：15~25℃

第25页,共130页，2024年2月25日，星期天潜水电泳第26页,共130页，2024年2月25日，星期天7.电泳染色溴乙锭(ethidiumbromide,EB)

结构及染色原理染色方法加入凝胶液中

电泳结束后染色第27页,共130页，2024年2月25日，星期天EB染色原理第28页,共130页，2024年2月25日，星期天第29页,共130页，2024年2月25日，星期天紫外灯下显色第30页,共130页，2024年2月25日，星期天8.DNA片段的回收低熔点琼脂糖法

透析袋电洗脱法(>5kb)DEAE-纤维素膜法(0.5~5kb)第31页,共130页，2024年2月25日，星期天（三）应用范围

DNA的分离、纯化和鉴定限制性酶切图谱分析重组体的分离、鉴定杂交分析

PCR产物的分离鉴定第32页,共130页，2024年2月25日，星期天琼脂糖凝胶电泳第33页,共130页，2024年2月25日，星期天二、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)

分离原理操作要点优点应用范围第34页,共130页，2024年2月25日，星期天（一）分离原理

电荷效应分子筛效应第35页,共130页，2024年2月25日，星期天PAGE支持物单体－丙烯酰胺(Acr)

交联剂－甲叉双丙烯酰胺(Bis)

催化剂－过硫酸胺(AP)

加速剂－N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)第36页,共130页，2024年2月25日，星期天聚丙烯酰胺凝胶第37页,共130页，2024年2月25日，星期天（二）操作要点凝胶的分类凝胶浓度的选择凝胶液的配制凝胶中DNA的检测DNA片段的回收第38页,共130页，2024年2月25日，星期天1.凝胶的分类非变性凝胶：dsDNA变性凝胶:ssDNA尿素甲酰胺SDS第39页,共130页，2024年2月25日，星期天2.凝胶浓度的选择第40页,共130页，2024年2月25日，星期天第41页,共130页，2024年2月25日，星期天3.凝胶液的配制

试剂(ml)制备浓度(%)3.55.08.0122030%Acr11.616.626.640.066.6ddH2O67.762.752.739.312.75XTBE20.020.020.020.020.010%AP0.70.70.70.70.7TEMED35ul/100ml第42页,共130页，2024年2月25日，星期天PAGE装置第43页,共130页，2024年2月25日，星期天第44页,共130页，2024年2月25日，星期天第45页,共130页，2024年2月25日，星期天第46页,共130页，2024年2月25日，星期天电泳第47页,共130页，2024年2月25日，星期天4.凝胶中DNA的检测溴乙锭染色法

银盐染色法甲醛还原放射自显影法Ag+－DNA

Ag（黑褐色）

第48页,共130页，2024年2月25日，星期天5.DNA片段的回收压碎浸泡法<1kb

纯度高，回收率低第49页,共130页，2024年2月25日，星期天（三）PAGE优点机械强度好、化学稳定性高分辨率高载样量大回收的DNA纯度高

第50页,共130页，2024年2月25日，星期天（四）PAGE应用范围分离、纯化和鉴定RNA和小分子DNA

DNA序列分析

PCR产物鉴定蛋白质的检测和分析第51页,共130页，2024年2月25日，星期天第二节分子杂交

分子杂交的基本原理固相支持物探针几种常用杂交技术第52页,共130页，2024年2月25日，星期天一、分子杂交的基本原理

核酸的变性和复性第53页,共130页，2024年2月25日，星期天分子杂交DNA-DNA第54页,共130页，2024年2月25日，星期天DNA-RNA第55页,共130页，2024年2月25日，星期天杂交条件

靶分子探针杂交袋杂交炉第56页,共130页，2024年2月25日，星期天杂交种类被检核酸种类和方法原位杂交斑点杂交Southern杂交Northern杂交Western杂交反应介质液相杂交固相杂交(

)第57页,共130页，2024年2月25日，星期天二、固相支持物固相支持物的特性结合能力强不影响杂交反应结合牢固非特异性吸附少机械性能良好

第58页,共130页，2024年2月25日，星期天固相支持物的种类硝酸纤维素滤膜(nitrocellulosefiltermembrane)

尼龙膜(nylonmembrane)第59页,共130页，2024年2月25日，星期天1.硝酸纤维素滤膜

特点吸附ssDNA和RNA

杂交信号本底低不足不适于重复杂交滤膜较脆不适于电转移印迹法对DNA小片段(<200bp)结合能力弱第60页,共130页，2024年2月25日，星期天2.尼龙膜特点结合能力强

可反复杂交

韧性强

适于电转移印迹法对DNA小片段(10bp)结合能力强不足杂交信号本底较高

第61页,共130页，2024年2月25日，星期天分子生物学考试时间：2005.1.11(晚7:00-9:00)地点9教讲演厅(150人)9-2-1(50人)9-2-2(50人)9-3-1(50人)答疑：1.10(9:00-11:30;3:00-5:30)地点：逸夫楼3楼生化实验室第62页,共130页，2024年2月25日，星期天三、探针(probe)探针的概念探针的类型

标记物的种类标记方法第63页,共130页，2024年2月25日，星期天1.探针的概念特异结合和检测靶分子的活性物质抗原－抗体配体－受体同源DNA/RNA第64页,共130页，2024年2月25日，星期天2.探针的类型基因组DNA探针

cDNA探针

RNA探针寡核苷酸探针蛋白质或多肽探针第65页,共130页，2024年2月25日，星期天3.标记物的种类放射性同位素(32P,3H,35S,125I,14C)

非放射性标记物生物素地高辛荧光素酶

第66页,共130页，2024年2月25日，星期天4.核酸探针的放射性标记方法

DNA缺口平移标记法随机引物标记法

DNA的5’末端标记

第67页,共130页，2024年2月25日，星期天缺口翻译特点均一标记制备dsDNA探针第68页,共130页，2024年2月25日，星期天随机引物标记法(randompriming)

随机引物6nt含有各种可能的排列顺序特点放射比活性>缺口翻译操作简便DNA/cDNA探针第69页,共130页，2024年2月25日，星期天第70页,共130页，2024年2月25日，星期天DNA的5’末端标记(5’endlabeling)

碱性磷酸酶＋T4多核苷酸激酶标记原理制备寡核苷酸探针制备短的DNA/RNA探针

第71页,共130页，2024年2月25日，星期天DNA的5’末端标记第72页,共130页，2024年2月25日，星期天四、Southern杂交Southernblotting/DNAblotting1975年，EdwenSouthern等印迹(blotting):转移

blot:aspotormark,esp.ofink

blotting

第73页,共130页，2024年2月25日，星期天1.印迹的方法

毛细管转移法

电转移法

真空转移法

第74页,共130页，2024年2月25日，星期天毛细管转移法第75页,共130页，2024年2月25日，星期天电转移法第76页,共130页，2024年2月25日，星期天真空转移法第77页,共130页，2024年2月25日，星期天第78页,共130页，2024年2月25日，星期天2.Southern杂交的步骤第79页,共130页，2024年2月25日，星期天3.Southern杂交的应用基因的定性及定量分析基因的酶切图谱分析基因突变分析RFLP第80页,共130页，2024年2月25日，星期天五、Northern杂交

RNAblotting

步骤

总RNA/mRNA→变性电泳分离→转移→杂交→放射自显影/化学显色

应用检测组织/细胞中mRNA的大小、量比较不同组织/细胞中基因的表达情况

第81页,共130页，2024年2月25日，星期天Northern杂交第82页,共130页，2024年2月25日，星期天六、Western杂交免疫印迹(immunoblotting)

SDS→转移→蛋白－第一抗体→标记的第二抗体(探针)→检测

应用蛋白质的定性定量分析第83页,共130页，2024年2月25日，星期天第84页,共130页，2024年2月25日，星期天免疫印迹第85页,共130页，2024年2月25日，星期天

Southern,Northern&Western

待测物质

支持物

探针

转移方式Southern

DNANC单链核酸

毛细管/电/真空

Northern

RNANC/尼龙单链核酸

毛细管/电/真空

Western

蛋白质NC/PVDF

抗体电转移

第86页,共130页，2024年2月25日，星期天七、原位杂交

(insituhybridization)定义种类细胞内原位杂交组织切片原位杂交

基本程序细胞/组织固定预杂交杂交冲洗杂交信号检测分析结果

第87页,共130页，2024年2月25日，星期天组织切片第88页,共130页，2024年2月25日，星期天第89页,共130页，2024年2月25日，星期天八、斑点杂交

(dothybridization)

第90页,共130页，2024年2月25日，星期天第三节PCR技术聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)PCR的发展简史PCR的基本原理和步骤PCR的影响因素PCR的种类PCR的应用第91页,共130页，2024年2月25日，星期天一、PCR的发展简史1971年,Korana提出核酸体外扩增的设想1985年,Mullis等发明了PCR技术1988年,PE-Cetus公司推出了第一台PCR仪

第92页,共130页，2024年2月25日，星期天二、PCR的基本原理和步骤基本原理－DNA复制三个步骤变性(denaturation)

退火(annealing)

延伸(extension)

第93页,共130页，2024年2月25日，星期天PCR的原理第94页,共130页，2024年2月25日，星期天PCR的扩增产物cycle

12345n长片段

246810短片段

002822长＋短

21222324252n第95页,共130页，2024年2月25日，星期天标准的PCR反应体系10X扩增缓冲液：10ul模板DNA:0.1~2ug

引物：各0.2~1umol/L4种dNTP:各200umol/LMg2+:1.5mmol/LTaqDNA聚合酶：2.5U总体积：100ul第96页,共130页，2024年2月25日，星期天第97页,共130页，2024年2月25日，星期天三、PCR的影响因素

模板引物

TaqDNA聚合酶

4种dNTP

Mg2+循环条件

第98页,共130页，2024年2月25日，星期天模板

DNARNAcDNA对模板的纯度要求低第99页,共130页，2024年2月25日，星期天引物长度：15～30nt

G+C含量：40~60%

碱基的随机分布避免引物自身和引物之间的互补引物的3’端引物的5’端引物浓度：0.2~1umol/L

第100页,共130页，2024年2月25日，星期天TaqDNA聚合酶

2.5U/100ul

－20℃保存最后加

第101页,共130页，2024年2月25日，星期天底物4种dNTP

的浓度相等终浓度：200umol/L

第102页,共130页，2024年2月25日，星期天Mg2+

浓度:1.5～2.0mmol/L

过高:非特异扩增

过低:反应产物减少第103页,共130页，2024年2月25日，星期天循环条件变性温度和时间:90~96℃,30~60s退火温度和时间:40~60℃,30~60sTm=4(G+C)+2(A+T)

延伸温度和时间70～75℃(72℃)<1kb,1min;3～4kb,3～4min;10kb,15min循环次数:25～35

第104页,共130页，2024年2月25日，星期天四、PCR的种类反转录PCR原位PCR(insituPCR)实时PCR(realtimePCR)重组PCR(recombinantPCR)锚定PCR(anchoredPCR)反向PCR(inversePCR)第105页,共130页，2024年2月25日，星期天原位PCR原位杂交＋PCR程序固定细胞/组织样品→PCR前处理→PCR扩增→原位杂交及检测

第106页,共130页，2024年2月25日，星期天实时PCR的原理第107页,共130页，2024年2月25日，星期天五、PCR的应用分子生物学研究临床医学第108页,共130页，2024年2月25日，星期天分子生物学研究基因克隆

DNA序列测定基因的体外定点突变

突变分析(PCR-SSCP)

基因定量

第109页,共130页，2024年2月25日，星期天临床医学病原体诊断

遗传病的基因诊断

肿瘤检测

法医学

第110页,共130页，2024年2月25日，星期天第四节DNA序列测定

Sanger双脱氧链终止法(1977)

Maxam-Gilbert化学裂解法(1977)第111页,共130页，2024年2月25日，星期天Sanger双脱氧链终止法原理－DNA复制

反应条件模板引物

dNTP（其中一种带放射性标记）

ddNTP

DNA聚合酶第112页,共130页，2024年2月25日，星期天DNA的复制第113页,共130页，2024年2月25日，星期天2’,3’-双脱氧核苷酸(ddNTP)第114页,共130页，2024