新生化颗粒中的阿魏酸含量测定

目录摘要 IAbstract II前言 1第一章局部原料药材研究概况 21.1 当归 21.2.1 化学成分 21.2.2 药理作用 21.2 川芎 31.2.1 化学成分 31.2.2 药理作用 41.3 红花 51.3.1 化学成分 51.3.2 药理作用 51.4 益母草 6第二章阿魏酸含量测定方法 72.1 仪器及材料 72.2 供试液制备的提取条件 72.3 系统适应性 82.3.1 仪器与试药 82.3.2 波长确定 82.3.3 选择色谱柱 82.3.4 选择流动相及比例 82.4 空白试验 82.5 线性关系考查 102.6 精密度试验 102.7 重复性试验 112.8 稳定性试验 112.9 回收率试验 122.10 含量测定计算方法 13第三章结果与讨论 143.1 波长确定 143.2 色谱柱的选择 143.3 流动相的选择 14参考文献 15致谢 16新生化颗粒中阿魏酸的含量测定摘要目的：建立高效液相色谱法测定新生化颗粒中阿魏酸的含量。方法：采用DiamonsilHPLCC18(5um,4.0×250mm,迪马公司)色谱柱，经对本品在190nm-400nm波长范围内检测，316nm波长处阿魏酸吸收峰灵敏度较高，其他杂质峰无干扰，别离最理想，应选316nm，乙腈-0.1%磷酸溶液〔11：89〕为流动相，流速1.0mL/min，理论塔板数3000以上，进样量10。结果：阿魏酸进样量在0.009176~0.165168范围内，浓度与峰面积的线性关系良好,r=0.9999，阿魏酸平均回收率为99.20%，RSD=1.15%。结论：该方法准确、专属性强、重现性好，可用作为新生化颗粒质量控制的有效方法。【关键词】：新生化颗粒，阿魏酸，含量测定,高效液相色谱法。DeterminationofferulicacidinXinshenghuaparticlesAbstractObjective:ToestablishaHPLCmethodforthedeterminationantitussiveexpectorantferulicacidgranulescontent.Methods:DiamonsilHPLCC18(5um,4.0×250mm,DimaCorporation)column,asforthegoodsat190nm-400nmwavelengthrangedetection,316nmwavelengthabsorptionpeakofephedrinehydrochloridehighersensitivity,andotherimpuritiespeakswithoutinterference,thebestseparationwaschosen210nm±1nm,acetonitrile-KH2PO4(0.02mol/L)(containing0.2%triethylamine,adjustedwithphosphoricacidPHto2.7)(5:100)asthemobilephase,flowrate1ml/min,theoreticalplatenumbermorethan5000.Results:EphedrineHydrochloride0.009176ug-0.165168ugatagoodrelationshipbetweenthelinear,r=0.9999,averagerecoveryofferulicacid,99.20%,RSD=1.15%.Conclusion:Thismethodisaccurate,specific,reproducibleandcanbeusedasmaterialsinthedeterminationofferulicacid.【Thekeyword】:KEYWORDS:Xinshenghuaparticl;Ferulicacid;Contentdetermination;HPLC前言新生化颗粒是由当归、川芎、桃仁、甘草〔炙〕、干姜〔炭〕、益母草、红花等几位药所组成。经多年的临床实践证明，对治疗产后血虚，正气缺乏，寒凝血瘀，留阻胞宫，致恶露不行，小腹疼痛。产后血虚，本当培补，然瘀血不去，新血不生，治宜养血化瘀，使新血生，瘀血化，故名“生化”。本文主要对其所含成份中的阿魏酸进行含量测定，为制订该制剂的质量控制指标提供有力依据。阿魏酸(ferulicacid)，化学名为4-羟基-3一甲氧基苯丙烯酸，是来自于多种植物的一种酚酸，在细胞壁中与多糖和蛋白质结合成为细胞壁的骨架。研究说明阿魏酸是阿魏、川I芎、当归、升麻、木贼等多种中药的有效成分之～。现已发现，阿魏酸至少具有以下功能：抗血小板凝集和血栓；去除亚硝酸盐、氧自由基、过氧化亚硝基；抗菌消炎；抗肿瘤；抗突变；增加免疫功能；增强人体精子活力和运动性等。阿魏酸的抗菌消炎、抗血小板凝集和血栓等，与本制剂治疗产后血虚，正气缺乏，寒凝血瘀，留阻胞宫，致恶露不行，小腹疼痛有密切关系。该实验方法、思路等均较为普遍，但也是目前中药厂中最为常用的，由于时间以及自身知识水平有限，本课题也仅仅是对该研究方法进行了表皮上的探讨，其深层的科学意义还需要更深入的研究。局部原料药材研究概况当归当归［Angelicasinensis(Oliv.)Diels］为伞形科植物当归的枯燥根；主产于甘肃岷县、武都、漳县、成县、文县等地；味甘平，性温；功能补血和血，调经止痛、润肠通便[1]。化学成分当归的化学成分主要有多糖类、苯酞类、香豆素类、黄酮类、挥发油类化合物及其他成分[2]。1〕苯酞类化合物苯酞类化合物在伞形科植物挥发油中分布广泛，目前当归属中检测有25种苯酞类化合物，主要有藁本内酯(ligustilide)、正丁烯基苯肽(Z-butylidenephthalide)、丁基苯酞(butylphthalide)以及1998年通过HPLC-EPS-MS技术分析到的新蛇床内酯(neocnidilide)等，其中藁本内酯占此类化合物总量的60%以上[3]。2〕香豆素类香豆素类的主要成分为简单香豆素、呋喃香豆素、吡喃香豆素和双香豆素类。3〕有机酸类化合物当归中主要的有机酸类化合物是，阿魏酸钠(sodiumferulate，SF，当归素)。阿魏酸钠有去除自由基、减轻膜脂质过氧化、提高抗氧化酶活性的作用。4〕黄酮类化合物从当归中别离出3个查尔酮衍生物；别离出的黄酮苷有木犀草素-7-O-β-D葡萄糖苷(luteolin-7-O-β-D-gluco-side)以及木犀草素-7-O-芦丁糖苷(luteolin-7-O-rutinoside)。5〕挥发油成分当归中挥发油成分非常丰富[4].6〕多糖类当归多糖的各种不同多糖成分的根本糖单位有D-葡萄糖(D-glucose)、D-半乳糖(D-galactose)、D-木糖(D-xy-lose)、L-阿拉伯糖(L-arabinose)、甘露糖(mannose)、鼠李糖(rhamnose)、岩藻糖(fucose)以及葡萄糖醛酸(glucuronicacid)和半乳糖醛酸(galacturonicacid)[5]。7〕氨基酸当归含有丰富的氨基酸。文献报道，甘肃岷县当归中检出19种氨基酸，其中精氨酸的含量最大，谷氨酸次之，其中有赖氨酸、吉氨酸、色氨酸、蛋氨酸等8种为人体所必需但又不能自行合成的氨基酸[6]。8〕微量元素、维生素及其他成分有文献报道，当归含钾、钠、钙、镁、铝、硅、磷、铁、锰、镍、铜、锌、砷、钼、锡、硼、铼、钡、硒、镭、钛、钒、铬等23种微量元素，其中16种是人体所必需的[7]。药理作用1〕苯酞类研究发现［8］，蒿本内酯可以通过减轻氧化应激和抗细胞凋亡，从而保护缺血再灌注的脑损伤。2〕香豆素类当归的提取物进行NO去除力筛选，发现6种香豆素类化合物具有潜在的抑制NO生成作用。3〕阿魏酸钠胡小玲等［9］通过实验研究显示SF对CCl4肝损伤有保护作用。另外刘保新等［10］通过实验发现当归、阿魏酸钠对大鼠骨性关节炎(OA)软骨退变有明显的修复作用。杨艳秋等［11］发现阿魏酸钠能干预老年冠状动脉粥样硬化性心脏病心绞痛患者血液抗氧化能力和保护血内皮细胞功能。4〕黄酮类黄酮类化合物可以通过抗氧自由基，保护缺血再灌注损伤。5〕挥发油刘绍光等［12］发现挥发油可以降低狗、猫、家兔的血压，随着剂量的增加降压作用愈加明显。周远鹏等［13］研究显示当归挥发油可明显降低高血压犬的血压(177/130mmHg降至155/110mmHg)，对心率未见明显影响。6〕多糖卿轶等［14］研究发现当归多糖对大鼠肝性脑病有预防作用。徐露等［15］通过实验研究显示当归多糖有很好的抗衰老作用。另外当归多糖能提高造血功能，且能缓解结肠免疫损伤［16-17］。当归多糖还可以对辐射损伤的染色体畸变、卵巢损伤、胸腺继发性萎缩和造血功能障碍有恢复作用［18-19］。川芎川芎[LigusticumchuanxiongHort.]为伞形科藁本属植物川芎的根茎；主产于四川、江西、湖北、陕西等省区；其性温，味辛，微苦，具有活血行气祛风止痛之成效[1]。化学成分川芎含有挥发油、生物碱、酚性物质、有机酸、苯酞内酯及其他等成分。〔1〕挥发油对不同产地和品种的川芎水蒸气蒸馏所得到的挥发油进行了分析，其中主要成分为藁本内酯(1igustilide)、蛇床内酯(cnidilide)、新蛇床内酯(neocnidilide)、洋川芎内酯(senkyunolide)、3-丁基苯酞、3-亚丁基苯酞[20]。〔2〕生物碱从川芎中别离得到川芎嗪(chuanxiongzine)、黑麦草碱(pelolyfine)、L-异亮氨酸-L-缬氨酸酐、1-β-丙烯酸乙酯-7-醛基-β-咔啉、1-乙酰基-β-咔啉、L-缬氨酰-L-缬氨酸酐、三甲胺、胆碱、尿嘧啶、腺嘌呤和腺苷。〔3〕酚类及有机酸类北京制药工业研究所的研究人员等[21]从川芎酚性部位分得阿魏酸(ferulicacid)、瑟丹酸、大黄酚。(4)苯酞内酯类从川芎中分得藁本内酯、新川芎内酯、洋川芎内酯、3-丁基苯酞、3-亚丁基苯酞、4-羟基-3-丁基苯酞、丁基-3-羟基4，5-二氢苯酞、4，7-二羟基-3-丁基苯酞。药理作用〔1〕对心肌的作用川芎嗪能使心肌收缩力增强,对心肌缺血损伤具有较好的保护作用。濮哲铭等[22]发现川芎嗪能通过阻断内皮素受体而防止心肌缺血的发生。〔2〕有抗氧化、去除自由基以及细胞保护作用阿魏酸具有很强的抗氧化活性，对过氧化氢、超氧自由基、羟自由基、过氧化亚硝基都有强烈的去除作用。阿魏酸不仅能去除自由基，而且能调节人体生理机能，抑制产生自由基的酶，促进去除自由基的酶的产生。阿魏酸能大大增加谷胱甘肽转硫酶和醌复原酶的活性，抑制酪氨酸酶活性。阿魏酸能保护体内产生的过氧化物，特别是羟自由基、一氧化氮造成的细胞损伤。〔3〕对血液及心血管系统作用阿魏酸钠能明显抑制血小板聚集、抑制羟色胺、血栓素(TXA2)样物质的释放，选择性抑制TXA2合成酶活性，使前列环素PGI2／TXA2比率升高[23]。其抑制血栓素的机制可能为：一足选择性抑制血栓素合成酶；二是拮抗血栓索的作用；三是通过抑制磷脂酶A2(PLA2)阻止花生四烯酸游离，从而阻止TXA2，的牛成[23]。红花红花为菊科植物红花CarthamustinctoriusL.的枯燥花，主产于河北、河南、浙江、四川等省区；其性温，味辛；活血通经，散瘀止痛[1]。化学成分红花的化学成分比拟复杂，其中富含黄色素、红色素、黄酮类、聚乙炔类、吲哚类、甾族类、木质素类、脂肪酸、挥发油、烷基二醇类、有机酸类和甾醇类等化合物及红花中的主要色素成分二百五十多种[24]。药理作用红花具有扩张冠脉、降血压、耐缺氧、活血化淤和抗炎镇痛等多种药理学成效。〔1〕与成效相关的药理作用：1〕对实验性心肌缺血的作用红花对实验性心肌缺血、心肌堵塞或心律失常等动物模型均有不同程度的对抗作用。红花可使心肌缺血程度减轻，范围缩小，心率减慢，尤其对堵塞区的边缘区有明显的保护作用[25]。2〕对心脏的作用红花有轻度兴奋心脏，降低冠状阻力，增加冠脉流量和心肌营养性血流量的作用。3〕抗氧化作用红花水提液可去除羟自由基，抑制小鼠肝匀浆脂质过氧化；羟基红花黄色素A〔HSYA〕可去除羟自由基、抑制脂质过氧化反响，保护细胞膜；在多种血淤病症中，自由基反响对加剧血液循环障碍起了重要的作用，而红花有效成分HSYA的抗氧化效应对其活血化淤的作用具一定的奉献。4〕抗炎作用红花黄色素对甲醛性大鼠足肿胀、对组胺引起的大鼠皮肤毛细血管的通透量增加及对大鼠棉球肉芽肿形成均有明显的抑制作用。其抗炎的机理可能是通过降低毛细血管通透性，减少炎性渗出，抑制炎症过程病理变化的肉芽增生[26]。阿魏酸含量测定方法当归、川芎为本方中参加的原料药，其所含阿魏酸在本方中最为重要。仪器及材料高效液相色谱仪：SPD-10AVP,SH-IMADZU;CBM-20A(Z中央控制器)；SIL-20A；Lcsolution色谱数据工作站；250，超声波清洗器〔北京医疗设备二厂〕，实验使用甲醇、乙腈均为色谱纯，磷酸为分析纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。阿魏酸酸对照品购自中国药品生物制品检定所〔批号为110773-200611〕。新生化颗粒来自不同厂家的13批样品。供试液制备的提取条件对照品溶液的制备:精密称取阿魏酸酸对照品适量,加70%甲醇制成每1ml含9的溶液，即得。样品溶液的制备：取本品研细，称取3g,精密称定，于具塞锥形瓶中，精密加甲醇20ml，称定重量，超声处理1小时，取出，放冷，用甲醇补足减失重量，摇匀，用〔0.45µm〕滤膜滤过，取续滤液，即得。系统适应性仪器与试药高效液相色谱仪：SPD-10AVP,SH-IMADZU;CBM-20A(Z中央控制器)；SIL-20A；Lcsolution色谱数据工作站；250，超声波清洗器〔北京医疗设备二厂〕，实验使用甲醇、乙腈均为色谱纯，磷酸为分析纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。阿魏酸酸对照品购自中国药品生物制品检定所〔批号为110773-200611〕。新生化颗粒来自全国5个厂家，13批样品。波长确定从PDA图中可以看出对照品在324nm处有最大吸收。但紫外光谱扫描最大吸收为318nm，结合《中国药典》2005版一部当归含量测定项下选用的测定316nm波长，应选取316nm作为测定波长。选择色谱柱1〕Hypersi1ODS(5um,4.0×250mm,Agilent)色谱柱2〕Hypersi1ODS2(5um,5×200mm,大连依利特)色谱柱3〕Diamonsi1HPLCC18(5um,4.0×250mm,迪马公司)色谱选择流动相及比例1〕乙腈-0.085%磷酸溶液〔17：83〕2〕乙腈-0.085%磷酸溶液〔15：85〕3〕乙腈-0.1%磷酸溶液〔11：89〕结果说明在以下色谱条件下：用Diamonsi1HPLCC18(5um,4.0×250mm,迪马公司)色谱柱，乙腈-0.1%磷酸溶液〔11：89〕为流动相，流速1ml/min,柱温35℃，检测波长316nm，别离好，理论板数不低于3000，进样量10。空白试验根据本品处方和工艺，制备缺阿魏酸的空白对照样品，按质量标准的提取条件制备空白对照液，注入液相色谱仪器，记录色谱图。测定结果说明空白试验对阿魏酸色谱分析无干扰。图2.1阿魏酸对照品色图2.2阿魏酸供试品色谱图图2.3阴性对照色谱图线性关系考查精密称取阿魏酸酸对照品〔110773-200611〕适量，加70%甲醇制成每1ml含0.009176mg/ml的溶液。精密吸取上述溶液1ul、5ul、10ul、14ul、18ul按顺序进样，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，阿魏酸浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程，见图2.1。Y=3853638.636X-3047.485961r=0.9999结果说明阿魏酸进样量在0.009176～0.165168范围内，浓度与峰面积的线性关系良好。表2.3阿魏酸线性关系考察进样量含没食子酸的量〔g〕峰面积1l0.009176323365l0.0458817568910l0.0917634816314l0.12846449043218l0.165168635470图2.4线性图峰面积〔mAu.s〕进样量〔ug〕精密度试验精密吸取同一对照品溶液10，重复进样6次，阿魏酸峰面积RSD为1.01%，精密度良好。表2.4阿魏酸精密度实验结果实验次数峰面积RSD〔%〕13685541.0123735623369065436590653749686374413重复性试验取汉方制药新生化颗粒，按正文测定方法平行制备6份供试品溶液，进行含量测定，分别进样，6份样品中阿魏酸含量测定平均值为0.0486%；RSD为0.97%。此方法重复性好，数据统计如表2.5：表2.5重复性试验统计表次数称样量〔g〕峰面积含量〔mg/g〕RSD〔%〕13.00642790510.04880.9723.24532990160.048533.16772941380.048843048752.96712710460.048163.06212824340.0485平均0.0486稳定性试验取本品，按正文测定方法制备成供试品溶液，精密吸取供试品溶液10，每隔数小时进样一次，阿魏酸峰面积RSD为2.66%，说明样品在12小时内较稳定。数据统计如表2.6：表2.6稳定性试验结果时间〔小时〕峰面积RSD〔%〕03713202.6613655592364410437212583732481038088612393369回收率试验用加样回收法，精密称取含量〔含量为〔0.0486mg/g〕样品，各6份，分别精密参加一定量的阿魏酸对照品溶液，按样品溶液的制备方法处理，在同样色谱条件下测定。此方法回收率好。数据统计如表2.7：表2.7回收率试验结果取样量〔g〕阿魏酸的阿魏峰面积阿魏酸回收率〔%〕平均回收率〔%〕RSD〔%〕1.53422802160.148099.9399.201.151.54262814030.1486100.231.50022762710.145999.341.56212830710.1495100.131.49862742690.144898.011.49272731380.144297.59通过以上含量测定方法学考察的试验结果，质量标准草案中阿魏酸含量测定方法的线性考察、精密度试验、稳定性、重复性、加样回收率良好，此方法可行。含量测定计算方法本测定法采用外标一点法计算含量，计算公式如下：供试品溶液浓度计算：Cx=Cr×(Ax/Ar)〔1〕式中：Cr为对照品的浓度〔mg/ml〕。Ax为供试品溶液峰面积值〔mAU*S〕Ar为对照品溶液峰面积值〔mAU*S〕Cx为供试品浓度制剂含量计算：制剂含量〔mg/袋〕=(Cx×Vx×P)/Wx〔2〕式中：Cx为供试品浓度Vx为供试品溶液制备的总体积〔ml〕Wx为样品称量〔g〕P为平均装量〔g〕合并〔1〕、〔2〕式，其计算公式为：制剂含量〔mg/袋〕=(Cr×Vx×P×Ax)/(Wx×Ar)根据以上方法，测得三批样品的含量数据统计如表2.8：表2.8十三批样品的含量统计表编号批号规格含量〔mg/袋〕1200909046mg/袋0.24392200909056mg/袋0.29903200909066mg/袋0.31184200909076mg/袋0.36655200909086mg/袋0.75506200909096mg/袋0.85737200909106mg/袋0.28688200909116mg/袋0.37429200910016mg/袋0.315610200910026mg/袋0.508711200910036mg/袋0.199312200910046mg/袋0.462113200910056mg/袋0.4706平均0.4523从上表可看出，经对十三批样品的测定，说明本含量测定方法可靠，操作简便，符合高效液相色谱法《中国药典》2005年一部附录VID的规定。结果与讨论本文主要探讨采用高效液相色谱法测定新生化颗粒中阿魏酸的含量，从而摸索阿魏酸含量测定的方法，进一步研究制订其质量标准。波长确定高效液相色谱法在选择检测波长时，经高效液相色谱仪测定时，阿魏酸在324nm波长处有最大的吸收。但紫外光谱扫描最大吸收为318nm，结合《中国药典》2005版一部当归含量测定项下选用的测定316nm波长，应选取316nm作为测定波长。色谱柱的选择色谱柱的选择上，〔1〕Hypersi1ODS(5um,4.0×250mm,Agilent)色谱柱；〔2〕Hypersi1ODS2(5um,5×200mm,大连依利特)色谱柱；〔3〕Diamonsi1HPLCC18(5um,4.0×250mm,迪马公司)色谱柱；进行了优选，得出用〔3〕色谱柱。流动相的选择经用中国药典所记载流动相进行试验，得出用〔3〕流动相。①乙腈-0.085%磷酸溶液〔17：83〕②乙腈-0.085%磷酸溶液〔15：85〕③乙腈-0.1%磷酸溶液〔11：89〕，流速1ml/min,柱温35℃，检测波长316nm，别离好，理论板数3000以上。通过对十三批样品进行含量测定，因每袋盐酸麻黄碱的标示量为0.4523mg，13批样品含量测定结果，参照《中国药典》2005版一部当归药材含量测定项下阿魏酸含量的限度，考虑到药材来源的不同，提取、成型过程中的损失等，将含量限度以上述13批样含量制定，其中13批样品含量均在0.2430～0.8573mg/袋，含量最低为0.1993mg/袋，考虑13批样品都列入合格范围内。故规定本品限度为：每袋含当归和川芎以阿魏酸计〔C10H10O4〕计，不得少于0.15mg。含量测定使用，且耐用性良好。实验结果说明，本设计方法合理可靠，可作为本品质量控制的方法。参考文献康廷国、阎玉凝、吴德康等.中药鉴定学[M].北京.中国中医药出版社，2007.137-139.宋萍萍、孙明毅、徐增莱等.三种当归属植物的化学成分研究［J］.中草药，2007，38(6)：833-835.杨崇仁，陈江弢.当归属植物的研究进展［J］.天然产物研究与开发，2004，16(4)：359-365.宋立人.现代中药学大辞典［M］.北京：人民卫生出版社，2000：822.胡小平，李玉云，李先何.当归多糖的成分及药理学研究新进展［J］.中药材，2004，27(1)：70-72.黄伟晖，宋纯清.当归化学成分研究［J］.药学学报，2003，38.王海燕，陈汝贤，许鸿章.当归化学成分研究［J］.中国中药杂志，1998，23(3)：167-169.李明明，吴丽颖，赵彤，