(高清版)GBT 43650-2024 野生动物及其制品DNA物种鉴定技术规程

野生动物及其制品DNA物种鉴定技术规程2024-03-15发布2024-07-01实施国家标准化管理委员会I前言 l2规范性引用文件 13术语、定义和缩略语 13.1术语和定义 13.2缩略语 24样品采集与储存 24.1样品采集 24.2抽样 24.3取样与储存 24.4运输 35DNA鉴定程序的构成 46DNA鉴定程序 46.1样品前处理 4 56.3DNA纯化 56.4DNA质量评估 56.5检测方法 67结果表述 8追溯方法 9污染预防与处理 10实验室区域设置 11仪器和试剂要求 12实验室清洁 13安全防护 14废弃物处理 附录A(资料性)电泳检测程序 A.1常规电泳检测法 A.2芯片电泳检测法 A.3其他电泳检测法 附录B(资料性)通用引物序列信息 B.1Cytb基因通用引物 B.2COI基因通用引物 ⅡGB/T43650—2024B.312SrRNA基因通用引物 B.416SrRNA基因通用引物 附录C(资料性)通用引物PCR反应体系与反应程序 C.1反应体系 C.2反应程序 附录D(资料性)特异性PCR的引物、反应程序与反应体系 C.1高鼻羚羊(Saigatatarica)特异引物 C.2雪豹(Pantherauncia)特异引物 C.3豹(Pantherapardus)特异引物 C.4虎(Pantheratigris)特异引物 C.5黑熊(Ursusthibetanus)特异引物 附录E(资料性)qPCR反应体系与反应程序 E.1反应体系 E.2反应程序 附录F(资料性)dPCR反应体系与反应程序 F.1反应体系 F.2反应程序 参考文献 Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由国家林业和草原局提出。本文件由全国野生动物保护管理与经营利用标准化技术委员会(SAC/TC369)归口。本文件起草单位：东北林业大学、东北林业大学司法鉴定所、深圳华大生命科学研究院、中国海关科学技术研究中心、黑龙江省公安厅、哈尔滨检验检测认证集团有限公司、深圳华大法医科技有限公司、广东华大法医物证司法鉴定所、黑龙江省野生动物研究所、华南动物物种环境损害司法鉴定中心、南宁海关技术中心、南京警察学院、合肥海关技术中心、广西壮族自治区公安厅、东营市公安局。唐闳凯。1野生动物及其制品DNA物种鉴定技术规程1范围本文件规定了对野生动物及其制品的来源进行DNA物种鉴定时样品采集与储存、DNA鉴定程序的构成、DNA鉴定程序、结果表述、追溯方法、污染预防与处理、实验室区域设置等主要技术要求。本文件适用于野生动物及其制品来源物种的DNA检验鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/Z31233分立个体类产品随机抽样实施指南GB/T34796水溶液中核酸的浓度和纯度检测紫外分光光度法GA/T383法庭科学DNA实验室检验规范LY/T2501野生动物及其产品的物种鉴定规范NY/T541—2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。选定的标准区域的、用于物种鉴定的一段相对较短的保守DNA片段。DNA物种鉴定DNAspeciesidentification利用DNA检验技术对野生动物及其制品进行分类地位(科、属、种)的判定。利用计算机算法和程序，确定两个或多个核苷酸序列的相似性以至于同源性。人工合成的两段互补寡核苷酸片段，一段与靶区域5'端DNA模板链互补；另一段与靶区域3'端DNA模板链互补。2荧光探针fluorescentprobe5'端和3'端分别标记荧光基团和淬灭基团，并与目的DNA序列碱基互补的一段DNA片段。下列缩略语适用于本文件。BOLD:生命条形码数据系统(barcodeoflifedatasystem)Cytb:细胞色素b(cytochromeb)dPCR:数字PCR(digitalPCR)PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)qPCR:实时荧光定量PCR(real-timefluorescencequantitativePCR)RFLP:限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism)4样品采集与储存4.2.1形态特征完整、可分类识别的同类多个检材，按照GB/Z31233中的简单随机抽样或等距抽样规4.2.2具有部分形态特征、可简单分类的多个检材，先分类，再按照GB/Z31233中的简单随机抽样或等距抽样规定执行；或按照GB/Z31233中的分层抽样规定执行。4.2.3不具有可识别的形态特征的大批量检材，先按照GB/Z31233中的简单随机抽样或等距抽样规定执行，结果出现多个物种时，再按照GB/Z31233中的分层抽样规定执行。物种的个体数量可按鉴定结果所占比例核算。昆虫等小型无脊椎动物可整体取样，取适量或整体粉碎，收集到离心管或密封袋等储存介质中，干应先去除易污染的表层，宜采取新鲜洁净的组织或内脏5mm³以上，收集到离心管或密封袋等储取1cm²以上收集到离心管或密封袋等储存介质中，干燥常温、冷藏或—20℃保存。3整体送检或清洗后取不少于0.2g骨粉或牙粉(组织残留时宜取组织),收集到离心管或密封袋等整体送检或清洗后取不少于0.2g粉末等收集到离心管或密封袋等储存介质中，干燥常温、冷藏收集1根以上置于离心管或密封袋等储存介质中，干燥常温、冷藏或—20℃保存。4.3.6血液(血痕)宜选新鲜全血采集于EDTA抗凝管或采血卡。血痕宜用采样拭子等采集。抗凝管和采样拭子等用清洁容器或密封袋等收集1mL～5mL,密封，冷藏或一20℃保存。用消毒的镊子或勺等取整颗或在表层和内层各取不低于0.2g,收集到离心管或密封袋等储存介质唾液等用消毒的纱布、棉花或拭子等采集，晾干密封常温保存；或者直接密封，冷藏或一20℃保存；收集足量其他分泌物到离心管或密封袋等储存介质中，冷藏保存，宜尽快于一20℃保存。注：分泌物是指由腺体和组织器官分泌的物质。4.4.1样品宜尽快送检。干燥样品常温运输，鲜软组织等易腐败的样品应冷藏(特殊时干冰冷冻)运输。4.4.2每个样品应分别包装，在样本袋或容器外标记清楚，再将各样品放到统一包装袋或盒中。4.4.5疑似疫病(如禽流感等)动物样品，应先消毒处理后，包装按照NY/T541—2016中7.2的规定45DNA鉴定程序的构成DNA鉴定程序包括5个操作步骤，检材无形态鉴别特征时，有4大类方法可选；检材具有部分形态鉴别特征或理化鉴别指标等时，可与之结合进行综合判断，程序流程图如图1所示。1.1.样品前处理(见6.1)2.DNA提取(见6.2)3.DNA纯化(见6.3)4,DNA质量评估(见6.4)具有部分形态鉴别特征等5.1PCR法(见6.5.1)5.2等温扩增法(见6.5.2)5.5综合判断(见6.5.5)5.3基因组测序法(见6.5.3)5.4其他DNA方法(见6.5.4)5.检测方法(见6.5)无形态鉴别特征图1DNA鉴定程序流程图6DNA鉴定程序6.1样品前处理用75%乙醇或去离子水等清洗表面2次～3次，粉碎(必要时脱钙)处理。新鲜皮张等去除表层，剪碎或研磨。干燥皮张等应先用75%乙醇或去离子水等清洗2次～3次，缓冲液浸泡去除表层，再剪碎或研磨。新鲜干净组织直接剪碎或研磨。干燥组织应先用缓冲液浸泡、去除表层，再剪碎或研磨。5用75%乙醇、去离子水等充分清洗、剪碎。依据检材类型和DNA物种鉴定目标，确定DNA提取方法，应设置空白对照并严防交叉污染。6.2.2苯酚氯仿提取法适用于组织、血液等样品量充足的检材，按照GA/T383的相关规定执行。适用于组织、血液等样品量充足，且需要大片段DNA进行全基因组测序的检材。适用于组织、血液等样品量充足的检材，毛、羽等微量检材以及粪便等检材，应严格按照说明书操作。6.2.5磁珠法试剂盒适用于毛、羽等微量检材以及粪便等检材，应严格按照说明书操作。6.2.6全自动工作站法适用于大批量样品，应严格按照仪器说明书操作。6.2.7其他提取方法使用等效DNA提取试剂盒，或验证的新方法。可选择高质量纯化试剂盒或同行验证的纯化方法。6.4DNA质量评估按照GB/T34796方法，测定DNA浓度，并判定DNA纯度。评估DNA片段大小，判断DNA完整性(见附录A)。检测样品目标基因的Ct值，分析DNA含量。检测与DNA结合荧光染料的荧光强度，定量目标DNA的浓度。66.5检测方法应严格设置阴性对照(不加DNA的空白对照)与阳性对照(已知物种的DNA样品，必要时)。确定目标区域(如DNA条形码、Cytb基因等),选择通用引物(见附录B),按照反应体系和反应程序(见附录C)进行PCR扩增，电泳检测见附录A,有扩增产物且与预期大小一致，则纯化(按纯化试剂盒操作)或直接测序(混合样品克隆测序)。如无扩增产物，分析原因重新试验。使用BLAST或CLUSTAL等软件，将测序所得有效DNA序列与候选物种的标准序列进行序列比对，得到序列一致性结果；或在数据库中进行序列比对，选取一致性最高的序列及其他近缘物种的同注：多个数据库综合比对，包括但不限于自建标准数据库、国家动物核酸数据库以及各专项数据库、国际的BOLD和GenBank数据库等，注意甄别其数据的正确性。具体结果判定如下：a)与单一物种一致性最高，且≥99%,判定与已知物种一致，判定该检材“来源于×××(物种)”b)与两个及以上物种一致性最高，且≥99%,应加测基因，或判定该检材“来源于×××(物种)或×××(物种)……”或“检出×××(物种)或×××(物种)DNA成分”;c)与单一物种一致性最高，且在90%～99%之间，应加测基因，如仍未达到99%,应谨慎判定；d)或进化树中，位于同一单系分支且置信值达80%以上的物种即为检材所属物种，判定该检材e)因为检材质量原因，未获得有效DNA,或缺乏比对的标准序列，判定“无法判定”或"无法确定应严格设置阳性对照(已知物种的DNA样品，即检材疑似物种的DNA样品)和阴性对照(近缘物种的DNA和以无菌去离子水代替DNA模板的空白对照)。选择目标区域(如DNA条形码、Cytb基因等),并选择根据物种特异位点设计的物种特异性引物，确定反应体系和反应程序(见附录D),进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测(见附录A)。具体结果判定如下：7a)检材与阳性对照有扩增产物，产物的大小与DNA分子量标准比对时与预期大小一致，且阴性对照无扩增产物，则表示结果阳性，判定该检材“来源于×××(物种)”或“检出×××(物种)DNA成分”。若存在疑问可测序验证。b)阳性对照有扩增产物，且产物的大小与DNA分子量标准比对时与预期大小一致，检材和阴性对照均无扩增产物；或者检材扩增产物与预期大小不一致，则表示结果阴性，判定为“未检出×××(物种)DNA成分”。阴性结果谨慎判别，可更换方法验证。c)检材、阳性对照和阴性对照均有扩增产物且产物的大小与DNA分子量标准比对时，与预期大小一致，则表示试验污染，应分析原因，重新试验。检材、阳性对照和阴性对照均无扩增产d)因为检材质量原因无法获得有效DNA,判定“无法判定”或“无法确定具体物种”。应严格设置阳性对照(已知物种的DNA样品，即检材疑似物种的DNA样品)、阴性对照(非疑似物种的DNA)和空白对照(提取时设置的提取空白对照和以无菌去离子水代替DNA模板的PCR空白对根据选择的目标区域(如DNA条形码、Cytb基因等),选择物种特异性引物和荧光探针，确定反应体系和反应程序(见附录E),进行qPCR扩增。qPCR反应结束后，应设置无效基线范围。基线范围选择在3个～15个循环，如果有强阳性样本，应根据实际情况调整基线范围。阈值设置原则以基线刚好超过正常空白对照扩增曲线(无规则的噪声线)的最高点，且Ct值不出现任何数值为准。以下条件有一条不满足时，试验视为无效，应重做qPCR扩增：a)提取空白对照无特异性扩增曲线；b)PCR空白对照无特异性扩增曲线；c)阴性对照无特异性扩增曲线；d)阳性对照Ct值<35。具体结果判定如下。a)待测样品DNA物种特异性扩增的Ct值<35并有明显扩增曲线，阳性对照、阴性对照和空白对照扩增正常(含内参基因时，检测结果也为阳性),判定该样品“检出×××(物种)DNA成b)待测样品DNA物种特异性扩增的Ct值>40,阳性对照、阴性对照和空白对照扩增正常(含内参基因时，检测结果也为阳性),判定该样品“未检出×××(物种)DNA成分”。阴性结果谨慎判别，可更换方法验证。c)待测样品DNA成分的物种特异性扩增的Ct值介于35～40之间，阳性对照、阴性对照和空白对照扩增正常(含内参基因时，检测结果也为阳性),可加倍DNA模板量，重复试验，如果Ct值减小并拥有明显扩增曲线，阳性对照、阴性对照和空白对照依然扩增正常(含内参基因时，检8测结果也为阳性),判定该样品“检出×××DNA成分”。否则判为“未检出×××(物种)d)阳性对照、阴性对照和空白对照皆阴性(含内参基因时，检测结果也为阴性),试验无效。e)因为检材质量原因无法获得有效DNA,判定“无法判定”或“无法确定具体物种”。根据选择的目标区域(如DNA条形码、Cytb基因等),选择物种特异性引物和荧光探针，确定反应体系和反应程序(见附录F),进行dPCR扩增。反应有荧光信号为阳性，无荧光信号为阴性，软件记录每个样品的阳性和阴性数。正确度偏差不应超过标准值的25%,应符合数字PCR方法操作指南要求。具体结果判定如下：a)阳性对照、阴性对照和空白对照扩增正常，检材阳性，判定该检材“检出×××(物种)DNA成分”或“来源于×××(物种)”。若存在疑问可b)阳性对照、阴性对照和空白对照扩增正常，检材阴性，判定该检材“未检出×××DNA成分”。阴性结果谨慎判别，可测序验证物种。c)因为检材质量原因无法获得有效DNA,判定“无法判定”或“无法确定具体物种”。根据预判的物种范围和选择的目标基因，选择物种特异性引物或通用引物，确定反应体系和反应程序(见附录C),进行PCR扩增，电泳检测，若扩增产物片段大小正确，则进行下一步酶切反应。根据特异位点选择限制性内切酶，按该酶说明书反应条件酶切。酶解产物进行电泳检测，酶切片段数量和大小与目标物种预期一致，判定该检材为“检出×××(物疑问可更换方法验证。因为检材质量原因无法获得有效DNA,巢式PCR、溶解曲线法等PCR方法，以及公开发表在权威专业性期刊上的其他基于PCR的DNA物种鉴定方法，应经专家组评估、验证后使用。依据标准程序进行操作。96.5.2等温扩增法环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术等方法，应经专家组评估、验证后使用，依据方法验证的标准程序进行操作。注：等温扩增法是一类分子生物学技术的总称，在某一特定的温度下，扩大核酸的拷贝数。6.5.3基因组测序法DNA文库要基于被行业内广泛认可的测序平台的标准流程进行构建。基于文库构建方法，选择使用合适的测序平台进行全基因组测序。应严格把控测序质量。测序质量可以通过多种指标来评估，包括Q20、Q30和N区比例等。还应考虑测序深度和测序覆盖度。一般测序深度宜大于5倍。注：全基因组测序是指对生物检材进行整个基因组测序，包括长读长测序和短读长测序，用以获得物种完整的基因组序列信息。合适基因组区域的确定待测样本与其他物种进行序列的比较分析时(如构建系统进化树等),应选取各物种中的同源区域。一般宜过滤掉性染色体区域以及基因区，选择进化中性区域。全基因组物种鉴定分析选取疑似物种或其近缘物种的高质量基因组作为参考基因组，将待测个体与其他候选物种的测序数据比对到参考基因组上，进行遗传变异的检测，筛选出高质量SNP(单核苷酸多态性)位点，通过物种特异位点比较分析，或构建系统进化树，完成鉴定分析。结果与目标物种预期相符，判定该检材“检出×××(物种)DNA成分”或“来源于×××物种”。否则，判定该检材“未检出×××(物种)DNA成分”或“非来源于×××物种”。因为检材质量原因无法获芯片法以及利用新技术开发的DNA物种鉴定方法，经同行专家组评估、验证后，形成标准程序，可使用。6.5.5综合判断具有部分形态鉴别特征的检材，上述DNA结果可以结合形态学特征综合判断；还可以结合地理分布、理化鉴别指标等综合判断。7结果表述7.2“×××”检材“为×××(物种)×××(制品名称)(结合形态或理化指标时)。7.3“×××”检材“来源于×××(物种)或×××(物种)……”或“检出×××(物种)或×××(物8追溯方法8.1标记方法在执行4.3和6.1过程中，标记的内容包括：样品编号、取样日期、样品类型、其他。在执行第6章其他过程中标记样品编号。在执行第6章所规定的程序过程中，记录并保持以下内容：执行各程序的人员姓名、操作日期、执行的操作内容、操作的结果或观察到的现象、其他。9污染预防与处理按照LY/T2501的相关规定执行。10实验室区域设置按照LY/T2501的相关规定执行。11仪器和试剂要求按照LY/T2501的相关规定执行。12实验室清洁按照GB/T19495.2的相关规定执行。13安全防护按照LY/T2501和GB/T19495.2的相关规定执行。14废弃物处理按照GB19489的相关规定执行。(资料性)电泳检测程序A.1.1试剂与仪器A.1.1.3核酸荧光染料。A.1.1.4琼脂糖。A.1.1.6电泳仪器。A.1.1.7微量移液器。A.1.1.8紫外透射仪或凝胶成像系统。A.1.1.9微波炉。A.1.1.10电子天平。A.1.2.1配制琼脂糖凝胶A.配制1×TAE缓冲液取50×TAE缓冲液20mL,加水至1000mL,配制成1×TAE稀释缓冲液，待用。称取1g琼脂糖，置于200mL锥形瓶中，加入100mL1×TAE稀释缓冲液，放入微波炉加热至琼脂糖全部溶化，取出摇匀，为1%琼脂糖凝胶液。胶板制备步骤如下。a)将胶槽置于水平支持物上，插上样品梳。b)琼脂糖胶液冷却至50℃~60℃,加入10μL核酸荧光染料(如SYBRGreen、SYBRGold等)溶液使其终浓度为1/10000(根据染料不同可调整),轻轻摇匀(也可取1μL～2μL染料工作液和5μL电泳样品混匀静置5min直接上样)。慢慢地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。检查并排除气泡。c)室温下静置30min～45min,待琼脂糖溶液完全凝固，垂直拔出样品梳，注意不要损伤梳底部凝胶；将凝胶放入电泳槽中。d)加入电泳缓冲液(1×TAE)至电泳槽中，使液面高于胶面。取9μL检测样品与1μL(1/10体积)的10×DNA上样缓冲液混匀，用微量移液器小心加入样品槽中。避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。A.1.2.3电泳接通电泳仪电源，按照需要调节电压，电泳开始，观察电流情况或电泳槽中负极的铂金丝有气泡出现。根据片段大小电泳15min～30min,关闭电源。取出凝胶，在波长为302nm(或365nm)紫外光下观察。DNA存在处显示出肉眼可辨的荧光条带。观察时应有防护，以免损伤眼睛。A.2芯片电泳检测法按仪器说明书操作。A.3其他电泳检测法按各透射仪的仪器说明书操作。(资料性)通用引物序列信息B.1Cytb基因通用引物mcb398:5'-TACCATGAGGACAAATATCATTCTG-3'mcb869:5'-CCTCCTAGTTTGTTAGGGATTGATCG-3PCR产物472bp,可扩增脊椎动物和无脊椎动物(Verma&.Singh,2003)。L14724:5'-GATATGAAAAACCATCGTTG-3'H15149:5'-CTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3'PCR产物约442bp,可扩增脊椎动物(Kocheretal.1989)。L14841:5'-AAAAAGCTTCCATCCAACATCTCAGCATGAAA-3'H15149:5'-CTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3'PCR产物约381bp,可扩增脊椎动物(Kocheretal.1989)。L14724:5'-GATATGAAAAACCATCGTTG-3'H15915:5'-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3'PCR产物约1140bp,可扩增脊椎动物(Xiaoetal.2001)。B.2COI基因通用引物LCO1490:5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'HCO2198:5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'PCR产物约750bp,可扩增脊椎动物和无脊椎动物(Folmeretal.1994)。FishF1:5'-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3'FishR1:5'-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3'PCR产物约710bp,可扩增鱼类(Wardetal.2005)。B.312SrRNA基因通用引物L1091:5'-AAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-3'H1478:5'-GAGGGTGACGGGCGGTGTGT-3'PCR产物440bp,可扩增脊椎动物(Kocheretal.1989;DelPeroetal.2000)。B.416SrRNA基因通用引物16SA:5'-GTGCAAAGGTAGCATAATCA-3'16SB:5'-TGTCCTGATCCAACATCGAG-3'GB/T43650—2024PCR产物约440bp,可扩增脊椎动物和无脊椎动物(Ramadan,2011)。16SAR:5'-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3'16SBR:5'-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3'PCR产物长约572bp,可扩增脊椎动物和无脊椎动物(Inoueetal.2001)。16S-F:5'-TRACTGTRCAAAGGTAGC-3'16S-R:5'-TTAATTCAACATCGAGGTC-3'J12888:5'-CCGGTCTGAACTCARATCATGTA-3'N13889:5'-ATTTATTGTACCTTKTGTATCAG-3'PCR产物1049bp,可扩增脊椎动物和无脊椎动物(Simonetal.2006)。注：根据发表文献等公开信息进行验证、补充引物。(资料性)通用引物PCR反应体系与反应程序C.1反应体系表C.1反应体系试剂加样量(50μL反应体系)ddH₂OTaqMix(2×)DNA注：预试验反应体系减为20μL。C.2反应程序LCO1490/HCO2198:94℃/5min;(94℃/30s,45℃→50℃/30s,72℃/60s)6个循环；(94℃/30s,52℃/30s,FishF1/FishR1:L14724/H15149和L14841/H15149:L14724/H15915:C.2.416SrRNA基因(资料性)特异性PCR的引物、反应程序与反应体系D.1.1引物序列D.1.2反应程序D.1.3反应体系反应体系见表D.1。试剂加样量(20μL反应体系)ddH₂OTaqMix(2×)DNA注：变性温度和退火、延伸时间根据不同的TaqMix做调整。如果调整退火温度，需经过试验确认。D.2雪豹(Pantherauncia)特异引物D.2.1引物序列D.2.2反应程序94℃/5min;(94℃/30s,60℃/30s,72℃/30s)35个循环；72℃/5min。D.2.3反应体系D.3.1引物序列Ppo-CbF:5'-GTAAATTATGGCTGAATTATCCGG-3'Ppo-CbR:5'-CATAACCGTGAACAATAATAD.3.2反应程序Pta-CbF:5'-TTTGGCTCCTTACTAGGGGTG-3'Pta-CbR:5'-CCGTAAACAATAGCACAATCCCGATA-3'PCR产物271bp(Sugimotoetal,2006)。D.4.2反应程序94℃/5min;(94℃/30s,60℃/45s,72℃/45s)35个循环；72℃/5min。D.4.3反应体系D.5黑熊(Ursusthibetanus)特异引物D.5.1引物序列Ut172f:5'-GACGCGACTACAGCCTTTTC-3'Ut367r:5'-CTATGAATGCGGTGGCTATAAC-3'PCR产物约217bp(Peppinetal,2008)。D.5.2反应程序(资料性)qPCR反应体系与反应程序E.1反应体系灭菌去离子补足反应体系总体积至20μL。注1:qPCRmix使用等效品牌试剂。引物和荧光探针的使用量根据具体物种及靶基因进行优化、调整和确认注2:每个样品设置2个平行样。E.2反应程序95℃/10min;95℃/10s,60℃/30s,(40个～50个)循环；60℃/min。循环在退火时收集荧光信号。注：不同仪器根据仪器要求，或根据不同物种鉴定方法调整循环参数。(资料性)dPCR反应体系与反应程序F.1反应体系20μL体系含2×ddPCRSupermixforpr物种特异荧光探针1μL、DNA模板10ng～100ng,无菌去离子水补足反应体系总体积至20μL。注：ddPCRSupermixforprobes,使用等效试剂。F.2反应程序95℃/3min;94℃/30s,(55℃~68℃)/30s,(40个～60个)循环。注：不同仪器根据仪器要求或不同物种鉴定方法调整参数。[1]陈浩峰.新一代基因组测序技术[M].北京：科学出版社，2016.[2]李金明.实时荧光PCR技术：第2版[M].北京：科学出版社，2016.[3]彭年才.数字PCR——原理、技术及应用[M].北京：科学出版社，2017.[4]彭涛.核酸等温扩增技术及其应用[M].北京：科学出版社，2018.[5]王廷华，刘佳，夏庆杰.PCR理论与技术：第3版[M].北京：科学出版社，2013.[6]张晓璐，白素英，徐艳春.赛加羚羊的分子生物学鉴别[J].东北林业大学学报，2006,34(3):forPublicationofQuantitativeReal-TimePCRExperiments[J].ClinChem,55:611-622.fGeneticClassificationinBushBabies[J].IntJPrimatol,21:889-904.Biotechnol,3(5):294-299.SystemforAbsoluteQuantitationofDNACopyNumber[J].AnalChem,83:8604-8610.osteanphylogeny:Resolvinghigher-levelrelationshigenetEvol,20(2):275-285.[14]JaneckaJE,JacksonR,MunkhtsogB,[J].GigaScience,2019,8(10)[16]KocherTD,ThomasWK,MeyerA,e6196-6200.tionofDNA[J].Nucleicacidsres,28:E63-E63.sicidentificationofAsiaticbl[19]PinheiroLB,Colema1003-1011.[20]RamadanHA.2011.Sequenceofspecificmitochondrial16SrRNAgenefragmentfromEgyptianbuffaloisusedasapatternfordiscriminationbetweenriverbuffaloes,cattle,sheepandgoats[J].MolBiolRep,38(6):3929-3934.[21]SchulmeisterS.2003.SimultaneousanalysisofbasalHymen