基因工程制药

关于基因工程制药基因工程定义：基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因在体外进行剪切和组合，然后与载体拼接，并通过载体转入到另一种生物体（受体）内，使其按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。基因工程的三大要素：供体，受体和载体第2页,共232页，2024年2月25日，星期天基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因在体外进行剪切和组合，然后与载体拼接，并通过载体转入到另一种生物体（受体）内，使其按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。基因工程的三大技术：

剪切，连接和转入第3页,共232页，2024年2月25日，星期天

除了少数RNA病毒外，几乎所有的基因都存在于DNA结构中，而用于外源基因重组拼接的载体也都是DNA分子，因此基因工程也称为重组DNA技术（DNARecombination）。另外，DNA重组分子大都需在受体细胞中复制扩增，故还可将基因工程表征为分子克隆或基因的无性繁殖（Molecularcloning）。第4页,共232页，2024年2月25日，星期天

基因工程技术是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。第5页,共232页，2024年2月25日，星期天2000年，法国科学家利用基因技术“制造”出了一只可以发出绿色荧光的兔子“Alba”。应用了受精卵显微注射技术，从水母身上采集了荧光蛋白，基因改良后，使它的发光率比原先提高了两倍，再将该基因植入到了兔子的受精卵中，由此培养出了会发光的兔子Alba。在普遍光线下，它看上去与其它同类没有区别，但是在较暗的光线下，它的身体就会放射出奇异的绿光来。

第6页,共232页，2024年2月25日，星期天基因工程基本过程第7页,共232页，2024年2月25日，星期天

上游技术指的是外源基因重组、克隆和表达的设计与构建（即狭义的基因工程）；而下游技术则涉及到含有重组外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养以及外源基因表达产物的分离纯化过程。第8页,共232页，2024年2月25日，星期天

广义的基因工程定义为DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。第9页,共232页，2024年2月25日，星期天从DNA出发的基因工程基本流程示意图供体细胞DNA抽提供体纯DNA剪切或PCR＋载体连接＋受体细胞DNA重组分子转入重组子复制表达产品分离纯化第10页,共232页，2024年2月25日，星期天基因工程的基本过程（1）从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA（包括外源基因或目的基因）和载体分子切开（简称“切”）；第11页,共232页，2024年2月25日，星期天第12页,共232页，2024年2月25日，星期天（2）用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片断接到载体上，形成DNA重组分子（简称“接”）；第13页,共232页，2024年2月25日，星期天（3）借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中（简称“转”）；第14页,共232页，2024年2月25日，星期天（4）短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（简称“增”）第15页,共232页，2024年2月25日，星期天（5）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效表达的基因工程菌或细胞（简称“检”）；第16页,共232页，2024年2月25日，星期天

可见，基因工程的上游操作过程可简化为：“切、接、转、增、检”五步）；第17页,共232页，2024年2月25日，星期天Example：TransferoftheInsulin（胰岛素）geneintoaplasmidvector第18页,共232页，2024年2月25日，星期天

基因工程的六大步骤：一.目的基因的获得；二.载体的制备；三.基因和载体的体外重组；四.重组基因的导入和重组子的检测；五.克隆基因的表达；六.基因工程产物的检测或分离第19页,共232页，2024年2月25日，星期天理论基础不同基因具有相同的物质基础；基因是可切割的；基因是可以转移的；多肽和基因之间存在对应关系；遗传密码是通用的；基因可以通过复制把遗传信息传给下一代。第20页,共232页，2024年2月25日，星期天1.不同基因具有相同的物质基础基因是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片段。第21页,共232页，2024年2月25日，星期天

不同基因具有相同的物质基础。地球上的一切生物，从细菌到高等动物和植物，直至人类，它们的基因都是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片段。而所有生物的DNA的基本结构都是一样的。因此，不同生物的基因（DNA片段）原则上是可以重组互换的。虽然某些病毒的基因定位在RNA上，但是这些病毒的RNA仍可以通过反转录产生。DNA并不影响不同基因的重组或互换。

A：肺炎双球菌转化实验

1944年美国微生物学家Avery，通过细菌（肺炎链球菌）转化（有毒与无毒）研究确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。

B：噬菌体转染实验

1952年AlfredHershy和MarshaChase用标记物的噬菌体（P32和S35）感染大肠杆菌，发现只有P32标记的DNA注入寄主细胞才能繁殖下一代进一步证明遗传物质是DNA。第22页,共232页，2024年2月25日，星期天碱基的结构A腺嘌呤T胸腺嘧啶G鸟嘌呤C胞嘧啶U尿嘧啶第23页,共232页，2024年2月25日，星期天DNA的结构第24页,共232页，2024年2月25日，星期天2.基因是可切割的限制性内切酶（RestrictionEnzyme），如EcoRI，HindIII等。第25页,共232页，2024年2月25日，星期天

基因直线排列在DNA分子上。除少数基因重叠排列外，大多数基因彼此之间存在着间隔序列。因此，作为DNA分子上一个特定核苷酸序列的基因，允许从DNA分子上一个一个完整地切割下来。即使是重叠排列的基因，也可以把指定的基因切割下来，尽管破坏了其他基因。第26页,共232页，2024年2月25日，星期天

限制酶EcoR1识别与切割序列限制酶Pst1识别与切割序列第27页,共232页，2024年2月25日，星期天限制酶HindⅡ的识别与切割序列第28页,共232页，2024年2月25日，星期天限制性内切酶常用限制性内切酶种类及特性W.Arber和H.O.Smith第29页,共232页，2024年2月25日，星期天

几乎所有种类的原核生物都能产生限制酶。根据结构和功能特性，可将限制酶分为三大类。其中Ⅰ类和Ⅲ类酶属复合功能酶，它们的限制性核酸内切活性及甲基化活性都作为亚基的功能单位包含在同一酶分子中，因此，严格地说应该称为限制-修饰酶。

Ⅱ类限制性核酸内切酶与其所对应的甲基化酶是分离的，不属于同一酶分子，而且由于这类酶的识别切割位点特异，能产生固定的DNA片段，因此基因工程所用的限制酶都是Ⅱ类限制酶。第30页,共232页，2024年2月25日，星期天其它工具酶连接酶T4DNALigase1967修补工具酶DNA聚合酶I大片断Klenow1971末端加工酶S1核酸酶，碱性磷酸单脂酶末端转移酶人工加polyA或polyT尾反转录酶第31页,共232页，2024年2月25日，星期天几种聚合酶特性比较第32页,共232页，2024年2月25日，星期天3.基因是可以转移的

基因不仅是可以切割下来的，而且发现生物体内有的基因可以在染色体DNA上移动，甚至可以在不同染色体间进行跳跃，插入到靶DNA分子之中。4.多肽和基因之间存在对应关系

现在普遍认为，一种多肽就有一种相对应的基因。因此，基因的转移或重组可以根据其表达产物多肽的性质来检查。第33页,共232页，2024年2月25日，星期天5.遗传密码是通用的生命的语言第34页,共232页，2024年2月25日，星期天所谓“中心法则”，是指遗传信息在细胞内的生物大分子之间转移或传递的基本法则。第35页,共232页，2024年2月25日，星期天

遗传密码是通用的。一系列三联密码子（除极少数的几个以外）同氨基酸之间的对应关系，在所有生物中都是相同的。也就是说遗传密码是通用的，重组的DNA分子不管导人什么样的生物细胞中，只要具备转录翻译的条件，均能转译出原样的氨基酸。即使人工合成的DNA分子（基因）同样可以转录翻译出相应的氨基酸。现在，基因是可以人工会成的。第36页,共232页，2024年2月25日，星期天6.基因可以通过复制把遗传信息传给下一代经重组的基因一般来说是能传代的，可以获得相对稳定的转基因生物。第37页,共232页，2024年2月25日，星期天分子克隆载体第38页,共232页，2024年2月25日，星期天

基因载体是一类能自我复制和功能基因表达的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目的)DNA而将目的DNA带入宿主细胞。第39页,共232页，2024年2月25日，星期天载体的分类：

从构建载体的DNA来源分，有质粒载体、病毒或噬菌体载体、质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的载体、以及质粒DNA与染色体DNA片段组成的载体等。从功能方面它们可分为克隆载体和表达载体，表达载体又分胞内表达和分泌表达载体。从表达所用的受体细胞分，可分为原核细胞和真核细胞表达载体。

第40页,共232页，2024年2月25日，星期天基因载体应具备的条件：①载体在细胞中必须能够进行独立自主地复制，因此载体应是一个独立的复制子，具有复制起始序列，可在细胞中进行有效扩增；②载体必须具有若干限制酶的单一切割位点，便于外源DNA的插入。并且由于这些酶切位点位于载体复制的非必需区，故插入适当大小外源DNA片段后载体仍然能够进行正常的复制；③载体必须具有可供选择的遗传标记，例如具有抗生素的抗性基因，便于对阳性克隆的鉴别和筛选。第41页,共232页，2024年2月25日，星期天多克隆位点ori复制起始点遗传标记Amppolylinker基因载体第42页,共232页，2024年2月25日，星期天抗药性标志的选择载体AmpTet插入片段Amp平板Tet平板第43页,共232页，2024年2月25日，星期天常规质粒载体第44页,共232页，2024年2月25日，星期天质粒(plasmid)

独立于细菌染色体以外的具有独立自主复制和调控能力的共价、闭合、环状的双股DNA分子（既cccDNA)。

Plasmidchromosome

第45页,共232页，2024年2月25日，星期天质粒克隆载体的特性:

(1)具有独立复制起点这是质粒在宿主细胞中进行扩增的必要条件。

(2)具有较小的相对分子质量相对分子量小有利于DNA的分离和操作，但也限制其克隆外源DNA片段的大小，一般不超过15kb。

(3)具有较高拷贝数每个细胞可含有10~200个拷贝的松弛型复制质粒,使外源DNA得以大量扩增。第46页,共232页，2024年2月25日，星期天

(4)具有选择性标记如抗生素的抗性基因，便于对克隆基因的检测和筛选。

(5)易于导入细胞质粒可通过转化或电穿孔等方法极易被导入细胞。

(6)具有安全性作为载体的质粒不具有转移功能，防止带有外源DNA的重组质粒扩散至实验室外，以免造成危害。第47页,共232页，2024年2月25日，星期天质粒的构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：

pSC101

8.8kb拷贝数5四环素抗性标记基因TcrColE16.5kb拷贝数20-30大肠杆菌内毒素标记基因E1RSF2124ColE1衍生质粒氨苄青霉素抗性标记基因Apr第48页,共232页，2024年2月25日，星期天人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒突变拷贝数控制基因拷贝数1000-3000扩增基因低拷贝质粒来自pSC101拷贝数小于10表达某些毒性基因温敏质粒在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合质粒装有整合促进基因及位点便于外源基因的整合穿梭质粒装有针对两种不同受体的复制子便于基因克隆表达质粒装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒装有报告基因便于启动子等元件的克隆筛选第49页,共232页，2024年2月25日，星期天

大肠杆菌质粒pBR322是基因工程中最常用和最具代表性的质粒，它是由Bolivar和Rogigerus等人于1977年构建而成的，是一个典型的人工质粒载体。

质粒pBR322结构第50页,共232页，2024年2月25日，星期天松弛型复制pBR322：氯霉素可扩增

用于基因克隆第51页,共232页，2024年2月25日，星期天①

可插入外源DNA大小为5kb左右，外源DNA若超过10kb，质粒在复制时就会变得不稳定。②

它具有一个复制起点，是松弛型质粒，故细胞中具有较高的拷贝数，每个细胞含有20~30个拷贝。当加入氯霉素扩增之后，每个细胞可含有1000~3000个拷贝，大大有利于重组质粒在细胞中的扩增。第52页,共232页，2024年2月25日，星期天③

pBR322还具有两种抗生素的抗性基因，一个是四环素抗性基因(Tetr)另一个是氨苄青霉素抗性基因(Ampr)。已知有24种主要限制酶在pBR322上都只有一个切点，其中有7种限制酶(E.coRV、NheI、BamHI、SphI、SalI、XmaIII、NruI)的切点位于四环素抗性基因之内，还有3种限制酶(ScaI、PvuI和PstI)的切点位于氨苄青霉素抗性基因之内。第53页,共232页，2024年2月25日，星期天④

外源DNA的插入而导致基因失活的现象，称为插入失活(insertionalinactivation)。第54页,共232页，2024年2月25日，星期天λ噬菌体载体第55页,共232页，2024年2月25日，星期天

噬菌体是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下,上述两种状态还会相互转化。噬菌体的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。第56页,共232页，2024年2月25日，星期天噬菌体生物学特性：噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶原状态，或处于溶菌状态.DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态第57页,共232页，2024年2月25日，星期天噬菌体的CⅡ蛋白，它是噬菌体基因转录的激活子，抑制裂解功能基因的表达，催化噬菌体DNA整合到细菌的染色体中去。高浓度的CⅡ蛋白促进溶源化，而低浓度CⅡ蛋白促进裂解生长。当CⅡ蛋白浓度足够时，激活基因cⅠ和基因int

的表达，导致噬菌体DNA整合到宿主的染色体上。

第58页,共232页，2024年2月25日，星期天λ噬菌体的生活周期：裂解λ侵入细菌-独立复制-裂解（冲破细胞膜）-再感染其他细菌。

第59页,共232页，2024年2月25日，星期天λ噬菌体从溶原转为裂解是一种可诱导过程。诱导的因素可能很多，实验室常用的是热诱导:

分离得到某些λ噬菌体，在低温时（30℃）建立溶原，用高温（420C）则出现裂解。这些λ噬菌体的cl基因是温度敏感突变型的，称为c1ts。

λclts1857，可作为组件插入质粒DNA内。目的基因插在λclts857下游，重组体的目的基因在42℃表达，30℃不表达。这种方法称为热诱导表达，使用的是温敏开关。λCIts857第60页,共232页，2024年2月25日，星期天l噬菌体结构5’TCCAGCGGCGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’

COSCOScos头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因l-DNA第61页,共232页，2024年2月25日，星期天

结构特点是功能相近的基因在基因组中聚集在一起。例如:

所有的编码外壳蛋白的基因都聚集在左端1/3处；控制基因组整合到寄主基因的基因位于分子中央；右端是负责裂解宿主细胞、DNA自主复制以及调控的基因；相关基因的聚集对λ基因组的表达是非常重要的，这能够使他们一起启动或关闭，而不是单独起作用。第62页,共232页，2024年2月25日，星期天l-DNA载体的构建：缩短长度

野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。第63页,共232页，2024年2月25日，星期天

其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：插入型载体取代型载体第64页,共232页，2024年2月25日，星期天插入型载体(小于10kb)λgt11第65页,共232页，2024年2月25日，星期天

取代型载体（20kb)第66页,共232页，2024年2月25日，星期天l-DNA载体的构建：加装选择标记

与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容比如插入型l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记颜色反应类标记第67页,共232页，2024年2月25日，星期天加装选择标记

imm434（噬菌体434免疫区段）Imm434基因编码一种阻止l-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活，l-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑。第68页,共232页，2024年2月25日，星期天加装选择标记

lacZlacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产生蓝色透明斑。第69页,共232页，2024年2月25日，星期天取代型载体

Spi（sensitivetoP2interference）筛选：野生型λ噬菌体在带有P2原噬菌体的溶原性E.coil的生长会受到限制的表型，即对P2噬菌体的干扰敏感。（这种生长抑制作用是受λ噬菌体red和gam这两个基因编码的产物控制的)。如果λ噬菌体缺少两个参与重组的基因red和gam，则可以在P2溶原性E.coil中生长良好。

因此，通过λ噬菌体载体DNA上的red和/或gam基因的缺失或替换，可在P2噬菌体溶原性细菌鉴别重组和非重组λ噬菌体。

第70页,共232页，2024年2月25日，星期天R.Young和R.Davis设计的

gt10和gt11是噬菌体克隆载体，可用于构建cDNA文库。一方面它们具有较高的克隆效率，1ngcDNA可产生5000个克隆，另一方面又可容纳较大分子量的外源DNA片段。因为筛选噬菌斑在技术操作上较筛选细菌菌落更方便，因此gt10和gt11类载体在构建文库时优于质粒载体pBR322。第71页,共232页，2024年2月25日，星期天λgt10为43.3kb，在它的阻遏基因cI中有唯一的EcoRI位点，cDNA插入到gt10中可使噬菌体阻碍物基因（cI）失活。外源cDNA片段（<7.6kb）插入此处时，使cI基因失活，形成了重组的cI-噬菌体，噬菌斑为清亮斑，可与非重组的噬菌斑所产生的阴暗噬菌斑相区别。第72页,共232页，2024年2月25日，星期天gt11则没有类似gt10载体的选择作用，但它是蛋白质表达的cDNA克隆载体。cDNA插入片段可表达成半乳糖苷酶—cDNA融合蛋白。

gt11中cDNA插入片段是克隆在-半乳糖苷酶基因编码区（lacZ）的羧基端，在含X-gal（5-溴-4氯-3-吲哚--D-半乳糖苷）的平板上，带cDNA插入片段的gt11可形成清晰的无色噬菌斑，未带cDNA插入片段的gt11则形成蓝色噬菌斑。第73页,共232页，2024年2月25日，星期天λ-DNA作为载体的优点:1)λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效感染大肠杆菌

2)λ-DNA作为载体，其装载外源DNA的能力远远大于质粒的装载量

3)重组λ-DNA的筛选较为方便

4)重组λ-DNA分子的提取比质粒容易第74页,共232页，2024年2月25日，星期天1)大肠杆菌培养至对数生长期

2)加入λ-噬菌体或重组λ-噬菌体悬浮液，37℃培养1小时

3)用新鲜培养稀释，继续培养4-12小时

4)高速离心，沉淀噬菌体

5)苯酚抽提，释放λ-DNA

6)乙醇或异丙醇沉淀DNA第75页,共232页，2024年2月25日，星期天λ噬菌体从溶原转为裂解是一种可诱导过程。诱导的因素可能很多，实验室常用的是热诱导:

分离得到某些λ噬菌体，在低温时（30℃）建立溶原，用高温（420C）则出现裂解。这些λ噬菌体的cl基因是温度敏感突变型的，称为c1ts。

λclts1857，可作为组件插入质粒DNA内。目的基因插在λclts857下游，重组体的目的基因在42℃表达，30℃不表达。这种方法称为热诱导表达，使用的是温敏开关。λCIts857第76页,共232页，2024年2月25日，星期天ori目的基因PL阻遏蛋白30℃下培养：第77页,共232页，2024年2月25日，星期天目的基因阻遏蛋白42℃下培养：失活第78页,共232页，2024年2月25日，星期天

到目前为止，基因工程中使用的载体基本上均来自微生物，主要包括六大类：质粒载体；

λ噬菌体载体；柯斯质粒载体；

M13噬菌体载体；真核细胞的克隆载体；人工染色体等。第79页,共232页，2024年2月25日，星期天基因工程药物制药的主要程序:

⒈目的基因的克隆，⒉构建DAN重组体，⒊DAN重组体转入宿主菌，⒋构建工程菌，⒌工程菌发酵，⒍表达产物的分离纯化，⒎产品的检验等。第80页,共232页，2024年2月25日，星期天目的基因的获得

⒈mRNA的纯化⒉cDNA第一链的合成⒊cDNA第二链的合成⒋cDNA的克隆⒌将重组体导入宿主细胞⒍cDNA文库的鉴定⒎目的cDNA克隆的分离和鉴定第81页,共232页，2024年2月25日，星期天

克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法。

一、逆转录法逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，在反转录成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。第82页,共232页，2024年2月25日，星期天第83页,共232页，2024年2月25日，星期天纯化mRNA的原理和方法第84页,共232页，2024年2月25日，星期天合成cDNA双链的第一步第85页,共232页，2024年2月25日，星期天合成cDNA双链的第二步第86页,共232页，2024年2月25日，星期天BluntbyT4DNApolymerasecDNA双链的接头处理第87页,共232页，2024年2月25日，星期天第88页,共232页，2024年2月25日，星期天抗药性标记基因插入失活法Amps：氨苄青霉素抗性基因失活Ampr：氨苄青霉素抗性基因Tets：四环素抗性基因失活Tetr：四环素抗性基因第89页,共232页，2024年2月25日，星期天第90页,共232页，2024年2月25日，星期天cDNA双链与插入型噬菌体载体及体外包装第91页,共232页，2024年2月25日，星期天

cDNA文库的构建过程第92页,共232页，2024年2月25日，星期天cDNA文库是一个生物体在特定生长状态下某个器官或组织中所有表达基因的集合，以cDNA重组子的克隆群表现。

cDNA插入片段小于10kb，可选质粒载体，如大于10kb则应选用噬菌体DNA为载体。第93页,共232页，2024年2月25日，星期天cDNA文库的鉴定：根据重组体的表型进行筛选，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑颜色改变法。第94页,共232页，2024年2月25日，星期天从cDNA文库中分离特异的cDNA克隆，主要采用：（1）核酸探针杂交法。用层析和高分辨电泳等技术纯化微克量的目的蛋白质，根据目的蛋白质纯品的氨基酸序列分析结果，人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。（2）免疫反应鉴定法。在既无可供选择的基因表型特征，又无合适探针的情况下，本法是重要途径。用表达型载体构建的cDNA文库，可用免疫学方法分组逐一鉴定各cDNA的表达产物，即以某种蛋白质的抗体寻找相应的特异cDNA克隆。第95页,共232页，2024年2月25日，星期天

分离得到含有目的基因的阳性克隆后，必须对其作进一步的验证和鉴定，主要是进行限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因测序等。

1985，PCR发明以后，RT-PCR得到了广泛的应用。第96页,共232页，2024年2月25日，星期天

二、化学合成法较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。第97页,共232页，2024年2月25日，星期天

用化学法合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。第98页,共232页，2024年2月25日，星期天

人工化学合成基因的限制有：⒈不能合成太长的基因。DNA合成仪所合成的寡核苷酸片段仅为50～60bp，因此只适用于克隆小分子肽的基因。第99页,共232页，2024年2月25日，星期天⒉遗传密码的简并使选择密码子困难，用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完全一致，易造成突变。⒊费用高。第100页,共232页，2024年2月25日，星期天外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞

基因的重组与转移

第101页,共232页，2024年2月25日，星期天第102页,共232页，2024年2月25日，星期天

DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。第一节DNA片段的体外连接第103页,共232页，2024年2月25日，星期天1.两段DNA的连接依靠粘性末端第104页,共232页，2024年2月25日，星期天2.DNA片断与载体的连接依靠粘性末端第105页,共232页，2024年2月25日，星期天ligasenick第106页,共232页，2024年2月25日，星期天DNA体外连接应注意的事项插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。第107页,共232页，2024年2月25日，星期天EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生GATC4个碱基的粘性末端。第108页,共232页，2024年2月25日，星期天2.DNA插入的方向正确用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI第109页,共232页，2024年2月25日，星期天3.插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定向插入（2）起始密码尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。ATGGAATTC载体ATGCGGAATTCT插入片断EcoRIEcoRIATGGAATTCT重组但移码突变！第110页,共232页，2024年2月25日，星期天4.防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。5’3’载体插入片断第111页,共232页，2024年2月25日，星期天载体和外源DNA插入片段的连接结果第112页,共232页，2024年2月25日，星期天1.载体自身环化连接（能存活）2.载体之间互相连接（能存活）3.插入片段互相连接（不能存活）4.一个载体与几个插入片段重组（能存活）5.几个载体与一个插入片段重组（能存活）第113页,共232页，2024年2月25日，星期天1.目的第二节重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌的制备第114页,共232页，2024年2月25日，星期天2.菌种使用丧失了限制体系的大肠杆菌。第115页,共232页，2024年2月25日，星期天①使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。②大肠杆菌的htpR基因突变减少蛋白酶的降解作用。③T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶,可把pin增加到载体上。使用突变菌株，减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。保护外源蛋白不被降解第116页,共232页，2024年2月25日，星期天用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理第117页,共232页，2024年2月25日，星期天4.制备过程培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃离心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70℃冻存用冰冷的60mMCaCl2重悬Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重悬第118页,共232页，2024年2月25日，星期天二、重组DNA导入大肠杆菌（1）转化（transformation)大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。（3）转染（transfection)真核细胞捕获DNA的过程。外源DNA导入细菌的几种方法（2）转导（transduction)借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。第119页,共232页，2024年2月25日，星期天转化率：每

gDNA转化成功的细菌克隆数。转化方法简单，但转化效率不高（106-108/

gDNA）。（1）热休克法（heatshock）转化效率高（高于109/

gDNA）。（2）电转化法第120页,共232页，2024年2月25日，星期天10ng载体DNA100

L感受态菌Onice混合，静置10分钟42ºC1分钟加入1mLLB培养基37℃摇1小时10-100

L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA（1）热休克法第121页,共232页，2024年2月25日，星期天LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成50-300

L电转仪调为2.5kV,25

F脉冲控制器200-400

0.5

g质粒DNAOnice混合加入1mLSOC培养液37°C中速震荡60分钟10-100

L转化液涂含抗菌素的平板转化（2）电转化法第122页,共232页，2024年2月25日，星期天平板培养基培养细菌10-100

L转化液涂于含抗菌素的平板37℃过夜第123页,共232页，2024年2月25日，星期天环形重组质粒质粒自我连接线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。①环形质粒数（1）重组质粒影响转化率的因素第124页,共232页，2024年2月25日，星期天①生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。②必须在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。④储存感受态菌要在-70℃以下③CaCl2处理⑤使用感受态菌时必须迅速融化融化后一般不能再次冻存使用。（2）感受态细胞（competentcells)第125页,共232页，2024年2月25日，星期天cDNA双链与插入型噬菌体载体及体外包装体外包装的噬菌体的转导第126页,共232页，2024年2月25日，星期天把重组的噬菌体

DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的

噬菌体颗粒。（1）体外包装（invitropackaging）（2）转导（transduction）通过受体菌细胞表面的

DNA接受器位点（receptorsite)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。第127页,共232页，2024年2月25日，星期天cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保持溶源性。

（3）cI857基因突变的

噬菌体

但当温度升高到44℃-45℃时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，

DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。第128页,共232页，2024年2月25日，星期天(4)体外包装过程第129页,共232页，2024年2月25日，星期天

体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每

g

DNA能形成106噬菌斑）。（5）转导第130页,共232页，2024年2月25日，星期天基因表达

基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。第131页,共232页，2024年2月25日，星期天

基因工程中基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。第132页,共232页，2024年2月25日，星期天

适合目的基因表达的宿主细胞应满足以下要求:

容易获得较高浓度的细胞；能利用易得廉价原料；不致病、不产生内毒素；第133页,共232页，2024年2月25日，星期天

发热量低、需氧低；容易进行代谢调控；容易进行DNA重组技术操作；产物的产量、产率高，产物容易提取纯化。第134页,共232页，2024年2月25日，星期天

宿主细胞分为两大类：第一类为原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；第二类为真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。第135页,共232页，2024年2月25日，星期天基因在原核细胞的表达⒈原核细胞⑴大肠杆菌

因为大肠杆菌的分子遗传学研究深入，生长迅速，所以目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。

第136页,共232页，2024年2月25日，星期天优点：全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善，具有各种载体和适用于表达生产蛋白的各种方法繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物第137页,共232页，2024年2月25日，星期天缺点：1大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。信号肽：能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。一般位于N端。细胞周质（格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分）。第138页,共232页，2024年2月25日，星期天信号肽(signalpeptide):(1)在真核生物未成熟分泌性蛋白质中,可被细胞转运系统识别的特征性氨基酸序列,

约15-30AA(含疏水AA较多)。(2)作用：把合成的蛋白质移向粗面内质网膜

(3)信号肽对靶向输送有决定作用。

第139页,共232页，2024年2月25日，星期天

信号肽的一级结构第140页,共232页，2024年2月25日，星期天2因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包涵体。

包涵体：是存在于细胞质中（某些条件下也在细胞周质中形成）的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。尤其当表达目的蛋白量超过细菌体总蛋白量10%时，就很容易形成包涵体。第141页,共232页，2024年2月25日，星期天

使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞。回收的蛋白生物活性差（空间构象的错误）。表达产物需经变性复性才恢复活性。②缺点①优点第142页,共232页，2024年2月25日，星期天外源蛋白在大肠杆菌中的积累第143页,共232页，2024年2月25日，星期天高表达产生的积聚物在细胞内部形成不溶物原因？①蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀；②蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；③蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；④表达蛋白过多，与其结合/诱导组分不足，不能形成溶解状态⑤蛋白质自身不稳定。第144页,共232页，2024年2月25日，星期天基因工程包涵体的纯化方法收集菌体细胞细胞破碎包涵体的洗涤目标蛋白的变性溶解目标蛋白的复性包含体的出现不仅增加了生物分离设计的难度，也为蛋白质折叠机理研究提出了新的课题。欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包含体后，溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。第145页,共232页，2024年2月25日，星期天1）包涵体的洗涤细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达产物为原则。第146页,共232页，2024年2月25日，星期天2）目标蛋白的变性溶解

包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性才能使其形成可溶性的形式。常用变性剂：▲

5-8mol/L盐酸胍和6-8mol/L尿素,作用：破坏离子间相互作用；▲

表面活性剂如1-2％SDS（十二烷基硫酸钠），作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。▲

PH>9.0的碱溶液和有机溶剂，使用较少。影响变性因素：时间、pH、离子强度、变性剂种类和浓度。第147页,共232页，2024年2月25日，星期天原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该过程称复性。复性方法：稀释法除变性剂－加入大量水或缓冲液。膜分离法除变性剂－透析、超滤、电渗析。层析法：凝胶层析，高效疏水层析P64----------3）目标蛋白的复性第148页,共232页，2024年2月25日，星期天149包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）第149页,共232页，2024年2月25日，星期天

来自发酵罐的菌体经过离心除去培养液后加入缓冲液悬浮，通入高压匀浆器反复破碎三次。匀浆经过离心和水洗除去细胞碎片，再添加溶菌酶、EDTA和促进剂以除去脂蛋白和未破碎的细胞。包含体经离心沉淀和水洗后进行变性溶解，溶解剂为6mol/L盐酸胍。溶解的同时通入空气氧化以打断错误连接的双硫键。离心除去沉淀，含变性蛋白质的上清液经超滤浓缩后过凝胶柱除去杂蛋白，再加入复性缓冲液进行透析复性。复性过程中产生的絮凝沉淀用离心除去。包含体产物分离工艺

（牛生长激素分离提取）第150页,共232页，2024年2月25日，星期天（1）O-糖基化（Ser,Thr）蛋白质糖基化增加蛋白质的稳定性和某些特殊性质。糖基3蛋白质不能糖基化第151页,共232页，2024年2月25日，星期天（2）N-糖基化（Asn）Dol：长醇Mannose：甘露糖Glucose：葡萄糖N-AcGlc：N乙酰氨基葡萄糖第152页,共232页，2024年2月25日，星期天

因没有真核翻译后加工的功能，表达产生的蛋白质，不能进行糖基化、磷酸化等修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构像折叠，因而产生的蛋白质常没有足够的生物学活性。第153页,共232页，2024年2月25日，星期天核糖体内质网高尔基体细胞膜合成肽链折叠、组装糖基化运输浓缩加工运输外排线粒体供能第154页,共232页，2024年2月25日，星期天翻译后加工一级结构的修饰:N-端Met(fMet)去除二硫键的形成个别氨基酸的修饰蛋白质前体中不必要肽段的切除多蛋白的加工羟化作用:羟脯氨酸羟赖氨酸酶活性中心的磷酸化分泌性蛋白一条合成后的多肽链经加工产生多种不同活性的蛋白质/多肽第155页,共232页，2024年2月25日，星期天信号肽颗粒识别、结合胞浆

带有信号肽的分泌蛋白粗面内质网通道识别信号肽酶切除信号肽肽链合并高尔基体进一步加工分泌出胞外带有信号肽的分泌性蛋白的加工、分泌的过程第156页,共232页，2024年2月25日，星期天第157页,共232页，2024年2月25日，星期天胰岛素的加工过程第158页,共232页，2024年2月25日，星期天●多蛋白的加工

一条合成后的多肽链经加工产生多种不同活性的蛋白质/多肽第159页,共232页，2024年2月25日，星期天4产物蛋白质N端多余一个甲硫氨酸残基，易引起免疫反应。5细胞周质内含有种类繁多的内毒素，其内毒素很难除去。6没有真核转录后加工的功能，不能进行mRNA的剪接，所以只能表达cDNA而不能表达真核的基因组基因。第160页,共232页，2024年2月25日，星期天⑵枯草芽胞杆菌分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产物降解。第161页,共232页，2024年2月25日，星期天⑶链霉菌作为外源性基因表达受到重视。不致病、使用安全、分泌能力强、表达产物可糖基化。第162页,共232页，2024年2月25日，星期天大肠杆菌中的基因表达第163页,共232页，2024年2月25日，星期天真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件：⑴载体能够独立复制。⑵应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。第164页,共232页，2024年2月25日，星期天松弛型复制pBR322：氯霉素可扩增拷贝数50-100/cell

用于基因克隆第165页,共232页，2024年2月25日，星期天pUC18/19：拷贝数2000-3000/cell用于基因克隆和测序装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’第166页,共232页，2024年2月25日，星期天⑶应具有很强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。⑷应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。第167页,共232页，2024年2月25日，星期天⑸应具有很强的终止子，只转录克隆的基因，所产生的mRNA较为稳定。⑹所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号AUG和SD序列，以便转录后顺利翻译。第168页,共232页，2024年2月25日，星期天核糖体结合位点大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’UAAGGAGG3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16SrRNA3’端区域3’AUUCCUCC5’并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译；翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子；

SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成；基因编码区5’

端若干密码子的碱基序列

第169页,共232页，2024年2月25日，星期天

pBV220是我国科学工用者自己构建的表达载体，使用了很强的PRPL双启动子，含有编码温度敏感性阻遏蛋白的cI857基因(在30-32℃时产生的阻遏蛋白能阻止PRPL的转录起始，细菌可以正常生长繁殖，42℃时该阻遏蛋白发生构像变化而失活，基因开始转录而表达。)常用表达载体

⑴pBV220系统质粒pBV220的结构第170页,共232页，2024年2月25日，星期天pBV220系统国内使用最多的载体,其组成:①来源于pUC8多克隆位点②核糖体rrnB基因终止信号③pBR322第4225～3735位④pUC18第2066～680位⑤λ噬菌体cIts857抑制子基因及PR启动子⑥pRC23的PL启动子及SD序列第171页,共232页，2024年2月25日，星期天pBV220系统优点：1PR和PL启动子串联，可以增强启动作用；2强的转录终止信号可防止出现“通读”现象，有利于质粒-宿主系统的稳定；第172页,共232页，2024年2月25日，星期天3.SD序列紧跟多克隆位点，便于插入带起始ATG的外源基因，可表达非融合蛋白；4整个质粒仅为3.66kb，有利于增加其拷贝数及容量，可以插入大片段外源基因；第173页,共232页，2024年2月25日，星期天5cIts857抑制子基因与PL启动子同在一个载体上，可以转化任何菌株，以便选用蛋白酶活性较低的宿主细胞，使表达产物不易降解。本系统为温度诱导，外源基因表达量可达细胞总蛋白的20%～30%；本系统宿主菌可以是大肠杆菌HB101、JM103、C600，质粒拷贝数较多，因此小量简便快速提取即可满足需要。产物以包含体形式存在。第174页,共232页，2024年2月25日，星期天

pBG-2是由pBV220系统衍生的便于产物纯化的融合表达载体。该质粒在PRPL启动子下游插入proteinG的IgGFc结合区基因片段180个碱基对，下游是多克隆位点，引入剪切融合蛋白的切点，具有与IgG结合的活性，可方便的在分离中用固定化的IgG进行亲和层析，简化下游处理工艺。融合表达质粒pBG-2的结构第175页,共232页，2024年2月25日，星期天真核基因在大肠杆菌中的表达形式（1）以非融合蛋白的形式表达药物基因

非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。优点：保持原有蛋白活性；缺点：易被蛋白酶破坏。第176页,共232页，2024年2月25日，星期天（2）以融合蛋白的形式表达药物基因

除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于N端，异源蛋白位于C端。

第177页,共232页，2024年2月25日，星期天以融合形式表达目的蛋白的优缺点:目的蛋白稳定性高

尤其对分子量较小的多肽效果更佳目的蛋白易于分离

利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白目的蛋白表达率高

与受体蛋白共用一套完善的表达元件目的蛋白溶解性好

由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性目的蛋白需要回收

融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段第178页,共232页，2024年2月25日，星期天融合蛋白表达质粒的构建原则：1.能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化。2.外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，为目的蛋白分离回收创造条件。第179页,共232页，2024年2月25日，星期天3.两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架4.两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺第180页,共232页，2024年2月25日，星期天

通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白。第181页,共232页，2024年2月25日，星期天目的蛋白的回收

融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白的空间构象和生物活性，如果将之注入人体还会导致免疫反应，因此在制备和生产药用目的蛋白时，将融合蛋白中的受体蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位点专一性断裂方法有两种：

化学断裂法酶促裂解法

第182页,共232页，2024年2月25日，星期天

用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为溴化氰（CNBr）它与多肽链中的甲硫氨酸残基侧链的硫醚基反应，生成溴化亚氨内酯，后者不稳定，在水的作用下肽键断裂，形成两个多肽降解片段，其中上游肽段的甲硫氨酸残基转化为高丝氨酸残基，而下游肽段N端的第一位氨基酸残基保持不变。化学断裂法：第183页,共232页，2024年2月25日，星期天

这一方法的优点是回收率高（可达到85%以上），专一性强，而且所产生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，与真核生物细胞中的成熟表达产物较为接近。然而，如果异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基，则不能用此方法。第184页,共232页，2024年2月25日，星期天启动子受体基因接头目的基因MetArgStopLysGluIle-Glu-gly-ArgArgLysGluIle-Glu-gly-Arg表达亲和层析酶解回收酶促裂解法凝血酶，肠激酶等第185页,共232页，2024年2月25日，星期天人胰岛素分子第186页,共232页，2024年2月25日，星期天人胰岛素在大肠杆菌中的表达溴化氰Cyanogenbromide：第187页,共232页，2024年2月25日，星期天⑶分泌型表达蛋白药物基因关键的编码分泌信号肽基因取自于大肠杆菌中分泌蛋白的基因ompa(外膜蛋白基因）。优点：在周质中稳定，有活性，不含甲硫氨酸残基；