T∕CACM 1027.105-2018 白及快速PCR鉴定

准T/CACM1027.105—2018QuicklyPCRidentificationofRhizomaBletillae中华中医药学会发布I 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 4 4 4 6 6 6 6 7 7 81GB/T6682分析实验室用水规格按一定规则取自某一整体，能反映该整体的相关信息，可以作为判断该整体情况的一个或多个部2聚合酶链式反应（PCR）polymerasechainre一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，即DNA片段的特异性体外扩增过程，其特异性依赖DNA位点差异，使用SNP（单核苷酸多态性）标记法进行鉴定。利用碱裂解法提取白及DNA，以白及DNA3波长范围应包含200nm～400nm，检测样品量至少应为0.1µL，检测精度应不低4溶解后加超纯水定容至1000mL，过滤40.4mM等量的脱氧核糖核苷三BJ59-412F：5’-GCCCAGAACAGCCATCCAAGTBJ59-412R：5’-TTGGCACGGAGCGACACG6.2.550×TAE（三羟甲基氨基甲烷-冰醋酸-乙二胺四乙酸二钠在800mL无菌双蒸水中溶解242.0gTris，37.2g乙二胺四），作间不同隔离区域进行，进入各区域应严格按照单一方向进行，即样品制备区à核酸制备区à扩增区检验样品应分为2批，每批可分为等量的3份，总量不低于100g。收样时应检查包装的完整性，并5检验样品、试样的抽取、分取应有代表性。在生产基地取样，送验样品可为组织或器官；在加工称取经预处理的检验样品20mg置于2.0mL离心管中；加入200µL提取缓冲液，充分混匀，在沸腾的-1离心1min或静置5min；转移上清液作为DNA模板待测或-20℃保存备用。每个检验样品应设置两份平行样，每一次在200µL的PCR管中进行，反应总体积为25µL，反应体系Taq酶PCR预混液7µL，鉴别引物各1µL6称取琼脂糖约0.2g，加入1×TAE电泳缓冲液10mL，加热至完全溶解，趁热将胶液涂布于大小适宜均匀层，垂直拔出梳子。取PCR扩增产物6µL，加入点样孔中。转移胶板至电泳仪中，加入1×TAE缓冲液至没过胶面约3mm处，调节电压至85V、85mA电泳约30min等溶液中染色。将染色后的凝胶转移至紫外凝胶成像系统中观察。阴性对照和空白对照无条带，且检在阴性对照、阳性对照和空白对照结果符合规定的情况下，若检验样品与阳性对照一致，则判定9结果报告样品经检测后，实验室应根据实验的具体操作程序和结果做好详细的实验记录，出具检测报告。7检测结果应来自同一实验室样品的两份检验样品。当一份检验样品的结果为阳性，另一份为阴性样品应至少检测2份平行样，核酸定量检测仪检测模板DNA的纯度和浓度，DNA浓度应高于10ng·µL-1。量，保证DNA的提取效率，避免出现假阴性结果。核酸扩增可设置PCR抑制剂对照。如果经过两次以上从核酸提取开始的重复检测，检测结果不一致，可在检测报告中注明检测低限，检测低限应符合最低检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理，有毒有害废弃物应经过除害再进行处理，处8中药白及具有收敛止血、消肿生肌的功效，可用于咳血吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂的治疗。历版《中华人民共和国药典》（2015年版一部）规定白及的原植物均为兰科白及属植物白及以黄花白及B.ochraceaSchltr.植物作为白及药材的药用来源。通过实地走及和同属植物黄花白及、小白及的植物形态相似，只有在开花期才能准确鉴定，市场上以黄花白及、极为普遍，而且以同科植物独蒜兰Pleionebulbocodioides(Franch.)Rolfe、苞舌兰pubescensLindl.、长距美冠兰EulophiafaberiRolfe、竹叶兰ArunHochr.，及市场上称为水白及多为二叶独蒜兰PleionescopulorumW.W.Smith、紫花美冠兰Eulophia使用的现象也屡见不鲜，白及疗效得不到保证。因此，准确鉴定白及，对白及药材的质量稳定、可控目前，针对白及的鉴别已有一些研究报道，但玉竹、射干、知母等植物为对象进行对比鉴别；也有研究显示白及与水白及的表皮细胞特征上有明显区别，可采用显微鉴别的方法快速鉴定两者。目前尚无有效鉴别白及与黄花白及、小白及等近缘物种部分白及与其7种近缘混伪品（黄花白及、小白子、种苗真伪的鉴定，以保障白及的准确种植，药材和饮片质量稳定、可控及临针对这些SNP位点设计了多对引物，并未获得鉴别效果较好的引物。鉴于白及与华白及的ITS2区域第3错配，以提高退火延伸反应的特异性。通过实验验证显示，根据ITS2的第3个碱基位点设计的引物BJ59-412F/BJ59-412R能特异性地扩增白及，可作为白及的特异性鉴BJ59-412F：5’-GCCCAGAACAGCCATCCAAGT-9BJ59-412R：5’-TTGGCACGGAGCGACACG-3’SNP位3B.striataCAGCCCGACCB.ochraceaTGACCCAGCTB.formosanaTAACCCAACTCAATTTAGCTTAAGATAATTS.pubescensTGATATAATTTAATATATT123456789BJ-10BJ-11BJ-12SpathoglottispubescensLinEulophiafaberiRolfeE.faberiRolfeE.faberiRolfeArundinagraminifolia(D.Don)用引物对P1（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）和p梯度下均能有效扩增白及（条带长度在350bp～400bp，见图A.3在59℃~68℃目的条带亮度最强，PCRSuperMix、TaqPCRMasterMix、Pre