微生物生态学的研究方法

1.直接测定法利用光学和电子显微镜对样品中微生物进行直接观察，并计算微生物数目或测定丝状微生物长度，其结果能够用每单位面积或每单位体积或重量微生物数目来表示，以此来预计生物量。其优点是能够使人们直接观察到天然样品微生物形态和微生物在自然样品所处位置。缺点是只能取少许样品，与微生物所生活整个自然环境相比，少许样品不能代表整个自然环境。

第一节微生物生态学研究传统方法微生物生态学的研究方法第1页2.培养法培养微生物方法是很多，普通来说对所采集样品应进行适当稀释，方便每一个平板上只能生长有一定数目标微生物菌落。其最大优点便是能够计算自然样品中活微生物数目，并能够识别真菌、放线菌和细菌。其缺点是造成计算误差原因很多。比如：A.自然中许多微生物细胞成群粘接在一起，用普通方法极难把它们分开，这么形成菌落可能是由许多个细胞增殖而来，而不是由单个细胞形成菌落.微生物生态学的研究方法第2页B.有些微生物在平板上只能形成微菌落，不便于肉眼观察。C.普通情况下试验室所用培养条件极难满足全部微生物生长，所用有限种类培养基也无法满足全部微生物生长。D.在平板上形成丝状微生物菌落不知是从孢子而来还是从菌丝而来。尽管如此，这种方法还是被广泛用于微生物生态学研究中，尤其适适用于研究细菌生态学.微生物生态学的研究方法第3页3.生理生化法同位素示踪法。我们知道一个微生物群体大小，那么经过测定H3标识胸腺嘧啶组入微生物群体DNA中速率便能够预计微生物代时。代谢活力测定法。是分析一些特殊酶类酶活力，这一方法是假设全部待测细胞都含有这些特殊酶类，而且全部细胞以一样能力使用这些酶类。

微生物生态学的研究方法第4页测定自然样品中ATP含量也能够反应微生物代谢活力大小和生物量大小。测定叶绿素含量和其它光合色素含量能够用来预计藻类和其它光合生物生物量和代谢活力。最广泛使用测定代谢活力方法是预计整个微生物群体呼吸作用和藻类光合作用，测定对象是O2和CO2量改变。微生物生态学的研究方法第5页生理学方法——Biolog微孔板法

BiologGN板是一个多底物96孔ELISA反应平板。除对照孔只装有四氮叠茂，其余95孔作为反应孔还装有不一样单一碳底物。在进行ELISA反应时，各孔中微生物利用碳底物，呼吸作用产生电子传递，引发四氮叠茂发生还原反应变为紫色。微生物对不一样碳底物利用情况可用发生反应孔分布及反应孔颜色改变――时间关系即群落水平生理图谱（CLPP）来表示。经过对孔中颜色改变光吸收值测量，可取得较系统信息。微生物生态学的研究方法第6页Biolog微孔板最初是由Biolog企业为了判定纯种微生物而设计，其碳源代谢指纹图可用来判定1900各种细菌、酵母和霉菌。1991年，Garland首次将Biolog微孔板应用于土壤微生物群落研究。现在Biolog微孔板已被广泛应用于描述各种环境包含土壤、淡水、沉积物、活性污泥和海水微生物群落生理情况。微生物生态学的研究方法第7页4.数学模型法

研究微生物生态学过程中惯用方法，是以感官观察为基础，经过一些试验将搜集资料加以分析和解释，并深入归纳、假设和推理。在这过程中，其结果大多数是描述性，数据基本是孤立。将数学研究应用于微生物生态学研究中，以统计数据和建立生态模型来定量描述微生物生态学问题。首先在试验室中建立人工经过简化环境。分解成许多小、较为简单亚系统。这些亚系统之间相互作用，亚系统之内各种原因作用则用数学方程式描述。能够大大地压缩真实过程时间、人力和物力，并在短时间内调查生态演变过程规律，并预测生态演变过程发展趋势，提供最优利用方案。

微生物生态学的研究方法第8页第二节微生物生态学分子生物学研究方法微生物分子生态学方法填补了传统微生物生态学方法不足，使人们能够避开传统分离培养过程而直接探讨自然界中微生物种群结构及其与环境关系。微生物生态学研究中采取分子生物学方法主要有核酸探针技术、PCR扩增技术、rRNA序列同源性分析方法、梯度凝胶电泳方法等。微生物生态学的研究方法第9页一、核酸探针杂交技术核酸杂交技术快速，能灵敏地探测出环境微生物中特殊核酸序列，而且用光密度测定法可直接比较核酸杂交所得到阳性条带或斑点就能得出定量结果，从而反应出相关微生物存在及功效。其基本原理是:人工合成能与某类群微生物特征基因序列互补寡聚DNA或RNA探针，并以荧光或放射性标识该探针，然后利用该探针与微生物基因杂交，经过荧光显微镜技术或放射自显影技术对微生物群落结构进行分析和研究。微生物生态学的研究方法第10页核酸探针杂交法基本步骤：先对rRNA(基因)序列比对，并对这些序列特异性进行判定，然后进行互补核酸探针合成和标识，最终对探针特异性和测定敏感性进行评价和优化。当前已经进行测序核酸序列数目很有限，这么对一些生态系统中存在微生物和核酸序列就不可能进行全方面了解，必须对各种生物16SrRNA和23SrRNA进行测序和研究，才能设计足够探针来监测高度可变目标样品中全部微生物。微生物生态学的研究方法第11页微生物生态学的研究方法第12页寡聚核苷酸探针由人工合成，普通为30kb左右，含有很高灵敏度，可用于检测环境微生物单一基因和点突变。当前应用较多寡聚核苷酸探针是依据细菌rRNA基因多拷贝且高度保守DNA片段设计。这种技术在微生物生态学研究时含有主要用途：（1）用于检测环境中微生物、指示生物及一些特定基因型存在是否；（2）用于检测某一特定环境中微生物种群、数量、分布及其改变，从而预测该环境中微生物种群改变趋势；（3）用于检测一些微生物特定基因型在环境中动态。微生物生态学的研究方法第13页伴随基因工程技术发展，新核酸分子杂交技术不停出现和完善，核酸分子杂交可按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。固相杂交包含:组织原位杂交、菌落原位杂交、斑点杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、固相夹心杂交、固化探针杂交、反向杂交。微生物生态学的研究方法第14页二、PCR特异性扩增技术

PCR技术主要特点是短时间内在试验室条件下人为地控制并特异扩增目标基因或DNA片段，使研究目标基因及其环境样品中微量微生物基因得到无限扩增，为这些基因和微量微生物种群研究提供了确保。使用PCR技术可将靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。

微生物生态学的研究方法第15页1、反转录PCR(RT-PCR)技术是利用反转录酶，使样品中mRNA反转录为DNA，然后利用DNA分析方法进行研究。即使在活微生物细胞中mRNA含量较高，但当细胞死亡和裂解以后，释放到环境中mRNA快速被降解。所以，RT-PCR技术常被用来分析环境样品中活体微生物生存情况和活性。微生物生态学的研究方法第16页2、竞争性PCR曾被用来测定受多环芳香烃污染沉降物中编码邻苯二酚-2，3-加双氧酶dmpB基因浓度。对PCR扩增dmpB基因片段进行人工改造，使其带有一个40bp大小缺失，作为PCR扩增竞争模板。所以，竞争模板PCR产物就比目标模板PCR产物短。用竞争性PCR对二者进行共扩增，经过与竞争模板浓度进行比较，来定量沉降物中dmpB基因浓度。微生物生态学的研究方法第17页3、限制性片段长度多态性技术(RFLP)是依据不一样生物个体或种群之间DNA片段酶切位点有所差异特点，利用限制性内切酶进行消化，产生长短、种类、数目不一样限制性片段，然后对这些特定DNA片段限制性内切酶产物进行分析，依据特定限制性酶谱图可对群落中微生物加以区分。微生物生态学的研究方法第18页限制性片段长度多态性技术需要依赖Southern技术，需要克隆基因探针，DNA用量较大且纯度要求很高，所以应用受到了一定限制。将PCR应用于RFLPPCR-RFLP技术则克服了这一缺点。4、PCR-RFLP法是将PCR引物中一条加以荧光标识，反应后用适当限制酶切、电泳分析，再依据片断大小不一样以及标识片断种类和数量不一样分析群落结构及组成多样性。此方法对微生物遗传多样性尤其是微生物种以下分类含有主要意义。微生物生态学的研究方法第19页5、随机引物扩增多态性(RAPD)也是应用比较广泛一项技术。RAPD是用那些对某一特定基因非特异性引物来扩增一些片段。RAPD分析用于探测含有混合微生物种群各种生物反应器中微生物多样性。用RAPD分析所得到基因组指纹图谱在比较一段时间内微生物种群改变以及比较小试规模和中试规模反应器方面是有用，但还不足以用来估测群落生物多样性。微生物生态学的研究方法第20页6、扩增片段长度多态性(AFLP)是RFLP技术和PCR技术相结合发展而成一个新型DNA指纹图谱技术。含有可靠、有效地揭示微生物多态性水平能力，为研究微生物属以下物种之间亲缘关系，乃至菌株间差异提供了非常有效伎俩。该技术主要步骤：（1）样品染色体DNA提取和纯化；（2）DNA修饰和模板制备；（3）AFLP反应；（4）聚丙烯酰胺凝胶电泳分析PCR产物；（5）放射自显影及数据数值分析。

微生物生态学的研究方法第21页AFLP技术与其它DNA指纹技术相比有其独特优点：（1）AFLP标识含有比RFLP、RAPD标识更为可靠、有效揭示物种多态性水平能力，为研究原核生物属以下物种之间亲缘关系，乃至菌株之间关系提供了一个有效伎俩；（2）含有一定灵活性，可经过特异性PCR引物设计和内切酶组合选择，来调整AFLP图谱中限制性片段适宜数目；（3）因为使用了严格PCR条件和高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳，因而重复性好，分辨率高。微生物生态学的研究方法第22页7、末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)，是依据16SrRNA保守区设计通用引物。其中一个引物5′端用荧光物质标识。提取待分析样品总DNA，以它为摸板进行PCR扩增，所得到PCR产物一端就带有这种荧光标识。将PCR产物用适当限制性内切酶消化。因为在不一样细菌扩增片段内存在核苷酸序列差异，酶切位点就会存在差异，酶切后就会产生许多不一样长度限制性片段。消化产物用自动测序仪进行检测，只有末端带荧光标识片段能被检测到，而其它没有带荧光标识片段则检测不到。这些末端标识片段就能够反应微生物群落组成情况，因为不一样长度末端限制性片段必定代表不一样细菌，也就是说一个末端限制性片段最少代表一个细菌。微生物生态学的研究方法第23页T-RFLP主要应用于微生物群落组成和结构、微生物系统发育及其菌种判定等研究，是一个应用比较广泛微生物生态学研究方法。该方法可降低图谱复杂性，使结果易于分析，且重复性好，结合克隆、测序，不但可对已知菌进行判定，还有利于发觉新未知菌，是细菌培养前大量筛查粪便标本菌群有用方法。微生物生态学的研究方法第24页8、单链构象多态性(SSCP)利用DNA片段核苷酸组成差异，造成单链构像不一样，使单链DNA或RNA分子在电泳时产生特异性谱带。被应用于微生物判定、微生物区系、微生物多样性等研究领域。此法原理是：DNA单链构象含有多态性，因为碱基序列不一样而影响其空间构象，它正常序列与变异序列单链构象不一样，所以在电泳上迁移率也不一样。从而能够在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中来分析DNA单链中基因突变。微生物生态学的研究方法第25页其主要步骤是：（1）提取细菌基因组DNA；（2）用PCR扩增16SrDNA或16S-23SrDNA间隔区片段；（3）将特异PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为含有一定空间结构单链DNA分子；（4）该单链DNA分子进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；（5）银染或放射自显影；（6）分析得到特异指纹图谱，与标准菌株图谱相比较，即可分析菌群，对菌株进行判定。亦可对特异条带回收、测序，进行菌种判定和分类。微生物生态学的研究方法第26页三、rRNA基因同源性分析方法rRNA基因同源性分析方法是综合应用多项分子生物学技术对细菌中rRNA基因进行分析，从而揭示微生物多样性。这是分子微生物生态学中最主要方法，取得结果也最多。rRNA在全部微生物中，功效和进化上是同源，同源物种之间rRNA结构是相当保守。所以，为了确定一个分离物为一个分类单元，或证实属于一个新分类单元，rRNA基因序列分析还是最可靠方法。微生物生态学的研究方法第27页rRNA序列分析技术与其它分子生物技术以及传统纯种培养相结合，具备分析微生物多样性及其发觉新物种能力，而且提供了一个摆脱传统纯种培养方法判定环境微生物路径，并已被广泛应用于对诸如共生细菌和古细菌、趋磁细菌、海洋微型浮游生物以及土壤细菌等微生物类群研究，并发觉了众多未知新序列。rRNA方法还应用到土壤细菌检测、基因工程菌安全性检验、环境中微生物间基因转移等很多方面。不过在实际应用中，存在基因文库构建、全部序列测定周期长，工作量大，费用高等问题。微生物生态学的研究方法第28页16SrRNA序列分析主要步骤：（1）提取基因组DNA；（2）利用16SrRNA基因两端保守序列作为PCR引物，PCR扩增且纯化；（3）以PCR产物为模板直接进行16SrRNA序列分析；（4）TA克隆建库或直接测序；（5）用BLAST对所得序列进行比对分析。

微生物生态学的研究方法第29页四、变性梯度胶电泳技术变性梯度凝胶电泳(DGGE)原理是使用一对特异性引物，PCR扩增微生物自然群体l6SrRNA基因，产生长度相同但序列有异DNA片段混合物。然后用DGGE分离产物混合物DGGE方法可用于微生物群落结构研究、微生物种群动态分析、富集培养物及分离物分析、核糖体RNA同源性分析。

微生物生态学的研究方法第30页该方法扩增环境样品16SrRNA部分基因序列(100~400bp)，经过DGGE或TGGE分离，搜集不一样条带DNA测序，再同基因文库中现有序列比较，即可确定微生物种类。该方法关键点在于PCR引物选择。因为扩增环境样品成份复杂，所以研究人员都选择了核糖体小亚基DNA保守序列作为引物。因为电泳限制，被分析片断不能大于400bp。为了便于电泳分析，提升分辨率，引物5′端有一个40bp左右发夹结构，提升了引物合成成本。微生物生态学的研究方法第31页微生物生态学的研究方法第32页DGGE对原水及活性污泥分析原水AS出水原水AS出水微生物生态学的研究方法第33页原水测序结果DGGEbandAccessionnumber%IdentityMostcloselyrelatedbacterialsequence1DQ10563997%Un