核酸分离纯化技术

核酸分离纯化技术核酸分离纯化技术第1页基因诊疗(genediagnosis)是利用分子生物学及分子遗传技术和原理，在DNA水平分析基因存在、判定疾病所包括基因置换、缺失或插入等突变，以诊疗各种感染性疾病和遗传性疾病，进行肿瘤分子水平研究。主要技术及过程区分或判定DNA异常分离、扩增待测DNA片断基因探针制备和标识核酸分离纯化技术第2页基因诊疗特点:高度特异性高度灵敏性实现早期快速诊疗被检测基因不一定活化，可检测表示差异基因。基础技术：（一）核酸分子杂交（二）聚合酶链反应（PCR）（三）单链构象多态性检测（四）限制酶酶谱分析（五）DNA序列测定（六）DNA芯片技术核酸分离纯化技术第3页第一节核酸分离与纯化意义：试验第一步工作，试验结果基础保障标准：确保一级结构完整性排除其它大分子污染要求：1.不能存在对核酸结构功效有影响物质2.降低蛋白、多糖、脂类分子污染核酸分离纯化技术第4页一、首先了解核酸存在状态及分布：形状：真核生物染色体DNA是双链线状，其细胞器DNA以及原核生物DNA，质粒DNA等都是双链环状。核酸分离纯化技术第5页多数生物体RNA分子是单链线状。而且，不一样类型RNA还有不一样结构特点。如真核生物mRNA多数有PolyA尾巴。至于病毒、类病毒所含DNA和RNA分子则形式多样，有双链线状、双链环状、单链线状、单链环状等。不论DNA还是RNA，在体内都形成一定高级结构。

核酸分离纯化技术第6页分布：

真核生物DNA主要存在于细胞核中，只有约5%在线粒体、叶绿体等细胞器中。RNA则75%左右存在于细胞质中，约15%在细胞器中，约10%在核中。原核生物DNA集中在核质区，RNA分散在细胞质里。细胞质各种RNA中，以rRNA数量最多（约占5%），tRNA其次（15-20%），mRNA最少（1-5%）。核酸分离纯化技术第7页油菜叶片总RNA非变性电泳（A）和甲醛变性电泳（B）结果核酸分离纯化技术第8页二．分离纯化核酸时注意事项要得到含有生物活性核酸大分子，在分离时必须防止核酸变性，并尽可能保持分子完整性，防止降解。所以，要注意以下事项：

１.尽可能简化操作步骤，缩短提取过程，以降低变性降解机会。

核酸分离纯化技术第9页２.降低化学原因对核酸降解ＰＨ４－１０，防止酸碱对核酸磷酸二脂键破坏3

,5

-磷酸二酯键核酸分离纯化技术第10页温度：最适温度４℃预防机械剪切力作用：基因组DNA：分子细长，轻易受到机械剪切力作用而断裂，所以机械剪切作用是分离DNA时主要危险。

３.降低物理原因对核酸降解核酸分离纯化技术第11页操作时动作必须轻缓，搅拌时要温和，防止让DNA溶液经过狭窄孔道。在提取缓冲液中加入蔗糖或山梨糖醇等增加溶液渗透压。提取分子量较小，结构又很紧密DNA，如小细菌质粒超螺旋DNA等时，机械剪切力威胁较小，操作时可无须过于慎重核酸分离纯化技术第12页核酸酶直接破坏核酸一级结构，必须抑制其活性对于DNA酶：大多数DNA酶作用时需要二价金属离子，如Ca2+,Mg2+等。所以只要加入EDTA（乙二胺四乙酸），螯合剂就能够基础上抑制DNA酶活力。

４.预防核酸生物降解核酸分离纯化技术第13页无所不在RNA酶：外源性RNA酶：RNA制备过程中用到玻璃和塑料制品、研究人员本身尤其是研究人员手，以及分离过程中用到试剂和溶液。内源性RNA酶：组织本身所固有，在一些组织中（如胰腺），或者在其特定生理状态（如快速发育期间）下含量很高。而且一当细胞破碎后即释放出来。对于RNA酶：其含有高稳定性，抗酸抗碱，具很广pH作用范围，抗高温严寒（0~65℃均含有活性）。而该酶作用时不需要二价金属离子，故用螯合剂无法抑制其活力。核酸分离纯化技术第14页三．核酸分离提取大致步骤：１.搜集细胞２.破碎裂解细胞（或细胞器）３.解聚核蛋白并去除蛋白质４.沉淀核酸并去除其它杂质（纯化）。核酸分离纯化技术第15页（一）破碎细胞1．机械破碎法经过机械运动所产生剪切力作用使细胞破碎方法，称为机械破碎法。

核酸分离纯化技术第16页

2．物理破碎法经过温度、压力、声波等各种物理原因作用使组织细胞破碎方法，称为物理破碎法。物理破碎法多用于微生物细胞破碎。常见物理破碎方法有：①温度差破碎法：利用温度突然改变，细胞因为热胀冷缩作用而破碎。该法简单易行，但效率不高，需重复几次才能到达预期效果。

核酸分离纯化技术第17页②压力差破碎法：经过压力突然改变，使细胞破碎。常见有高压冲击、突然降压及渗透压改变等方法。如红血球在纯水中会发生破壁溶血现象。③超声波法：超声波是破碎细胞或细胞器一个有效手段，且一次处理量较大。该方法主要缺点是超声空穴局部过热引发生物大分子变性，所以超声振荡处理时间应尽可能短，容器周围以冰浴冷却处理，尽可能减小热效应引发酶失活。核酸分离纯化技术第18页３.化学破碎法经过各种化学试剂对细胞膜作用使细胞破碎方法，称为化学破碎法。常见化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和Triton，Tween等表面活性剂。４.酶促破碎法经过细胞本身酶系或外加酶制剂催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而到达细胞破碎目标。核酸分离纯化技术第19页（二）核蛋白解聚和蛋白质去除

1．酚抽提法酚和氯仿是蛋白质变性剂，当它们与含核酸和蛋白质水溶液一起振摇时形成乳状液，蛋白质充分接触氯仿和苯酚而变性，与核酸分开。离心后分为两相，普通上层为含有核酸水相，下层为有机相，相界处则是变性凝聚蛋白质层。用有机溶剂处理核酸溶液时，既要使水溶液与有机溶剂充分接触，又要注意预防剪切力对DNA破坏。有机溶剂处理以去除蛋白质次数视蛋白质含量和制剂纯度要求而定，普通要处理到中间变性蛋白质层消失为止。核酸分离纯化技术第20页2．表面活性剂法破细胞时所用SDS等阴离子去污剂除了能够溶解膜蛋白和脂肪外，还可解聚核蛋白。3．蛋白酶水解法用蛋白酶水解去除蛋白质方法比较温和，可防止剪切力破坏。核酸分离纯化技术第21页

（三）核酸沉淀沉淀目标：改变核酸溶解缓冲液；调整核酸浓度；去除个别杂质及一些盐离子。

试验室常见核酸沉淀剂为乙醇和异丙醇。异丙醇：所用体积小（普通为2/3体积），普通不需要在低温下长时间放置。但异丙醇不易挥发除去。乙醇：很易挥发除去，但所需体积大（普通为2倍体积），且需要在低温下长时间放置（如沉淀RNA时普通要-20℃最少放置2小时）。核酸分离纯化技术第22页沉淀核酸时，普通还要加入一定浓度盐溶液，如NaAc或NaCl。这是因为在pH为8左右溶液中，核酸分子是带有负电荷，加一定浓度NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上负电荷，降低DNA分子之间同性电荷斥力，易于相互聚合而形成核酸盐沉淀。加入盐溶液浓度太低：只有个别核酸形成钠盐而聚合，这么就造成核酸沉淀不完全。加入盐溶液浓度太高时：核酸沉淀中有较高浓度盐存在，会影响到下游操作，比如DNA限制性酶切反应。此时必须要进行洗涤或重沉淀。核酸分离纯化技术第23页沉淀核酸时温度、所需时间以及沉淀后离心速度和时间，取决于核酸分子大小，浓度以及有没有助沉淀物存在。核酸分子越小、浓度越稀，沉淀时所需温度越低，时间也越长，离心时要求速度高、时间长。核酸分离纯化技术第24页（三）核酸洗涤离心沉淀得到核酸普通还要用70%乙醇洗涤以去除盐分及一些小分子杂质，真空抽干或室温晾干后溶于适当溶液中。核酸分离纯化技术第25页（四）核酸浓缩假如核酸溶液中DNA含量低，体积较大，不易进行乙醇沉淀时，可采取固体聚乙二醇吸水浓缩法或正丁醇抽提浓缩法进行浓缩。固体聚乙二醇吸水浓缩法：将待浓缩DNA溶液装入透析袋中，在透析袋外加适量固体聚乙二醇，使DNA脱水到达浓缩效果。正丁醇抽提浓缩法：利用个别水分子可分配于有机溶液中，使溶液体积降低，有机溶剂则不吸收溶液中DNA和其盐类分子。

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（五）核酸制剂保留分离提取到核酸制品在保留过程中要预防变性和降解。所以，溶解核酸溶液必须含有螯合剂以抑制DNA酶，溶液pH为7~8，预防酸碱变性，同时该溶液要有一定盐浓度，因为在纯水中核酸双链（或双链区）两条链上磷酸根负离子相互排斥，使双链分开而变性，Na+等正离子可中和磷酸根电负性，保持双链结构。现在较普遍是将DNA溶于TE溶液（10mmol/LTris,1mmol/LEDTA,pH8.0），-20℃保留。而RNA则通常溶于DEPC水中。核酸分离纯化技术第27页（六）核酸制剂纯度初步判定纯净核酸制品在260nm波优点有吸收高峰，230nm为吸收低谷。核酸紫外吸收曲线

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纯度：A260/A280：双链DNA为1.8，而RNA为2.0。含量：

50×A260样本×稀释倍数／1000＝双链DNAug/ul40×A260样本×稀释倍数／1000＝单链DNA／RNAug/ul33×A260样本×稀释倍数／1000＝单链寡聚核苷酸ug/ulDNA核酸分离纯化技术第29页第二节酚－氯仿抽提法分离基因组DNA

核酸分离纯化技术第30页酚／氯仿抽提DNA原理去除蛋白质最经典方法是酚／氯仿抽提法，也是最常见方法。酚氯仿抽提法原理是：利用核酸与蛋白质对苯酚变性作用含有不一样反应性分离核酸与蛋白质。在细胞破碎步骤后样品混合液中用苯酚抽提和高速离心后，样品中蛋白质成份被变性，或者变成不溶性物质，而核酸则溶解在水相中。。核酸分离纯化技术第31页苯酚抽提通常采取苯酚、氯仿和异戊醇混合溶液。这种混合溶液比单纯苯酚更有效地使蛋白质变性，而且有利于稳定RNA，随即氯仿、异戊醇抽提，将残留苯酚从水相中（含核酸）除去。最终用乙醇沉淀DNA，同时也可去除残留氯仿核酸分离纯化技术第32页试剂配制要求及作用酚重蒸馏和平衡酚易氧化，其氧化产物对DNA有破坏作用，使用前需要将酚进行重蒸馏。苯酚65℃熔化后，用空气冷凝管进行重蒸馏，183℃搜集纯净酚。因为酚是中强酸使用前要进行酚平衡，在纯净酚中加入等体积1mol/lTris-HCl缓冲液(pH8.0)并加入固体Tris，激烈震荡使酚pH值平衡到8.0。酚中常加入抗氧化作用8-羟基喹咛，8-羟基喹咛使酚展现黄色，可作为指示颜色。将酚保留于棕色瓶中，表面覆盖一层0.1mol/lTris-HCl(pH8.0)预防氧化。核酸分离纯化技术第33页酚／氯仿／异戊醇混合液配制氯仿为挥发性有机溶剂，可使蛋白质变性，加入氯仿能够:1.降低酚用量；2.使蛋白质变性更为彻底；3.同时可抑制核酸酶活性。异戊醇可消除抽提时有机相和水相之间产生气泡，有利于分层。通常按酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1百分比将三种试剂混合，要求用时暂时配制。核酸分离纯化技术第34页主要所需试剂及消耗品:TES溶液蔗糖-TES溶液溶菌酶(50mg/ml)EDTA溶液(0.25mmol/ml)SDS溶液(10g/l)饱和酚:氯仿:异戊醇(PH8.0)NaAc（3mol/l）无水乙醇，70%乙醇核酸分离纯化技术第35页实例：原核生物（大肠杆菌）基因组DNA分离纯化过程1.吸收已培养好大肠杆菌液体5.0ml于中号试管中,4000转/min离心15min，弃去上清，加入一定体积TES液，洗菌体1~2次，如上述方法搜集菌体，将培养细菌一些营养物清洗洁净。2.弃去TES液后，管底菌体大约200ul±，加入五倍体积预冷蔗糖-TES液约1ml，在冰浴中充分混匀，加入溶菌酶（50mg/ml）至终浓度1mg/ml，（计算方法，50×x=1×1,x=0.02ml）充分混匀后，在0℃处理15min该步骤作用为破坏细胞壁，为了预防酶变性，需低温处理，同时加EDTA抑制DNA酶。核酸分离纯化技术第36页3.加入EDTA（0.25mol/l）至终浓度为0.1mol/l(计算为0.25×X=0.1（1+X）约取0.25mol/lEDTA600~700ul轻轻混匀后，0℃处理10min。充分抑制DNA酶活性，再加入SDS或（蛋白酶K）溶液至终浓度为10g/l，混匀，于37℃裂解30min，94℃裂解1min。该步骤为裂解细胞膜：裂解胞膜能够用蛋白酶K，因为蛋白酶K价格较高，所以常见SDS（胞膜双脂层。SDS为十二烷基磺酸钠，为一个表面活性剂，能破坏双脂层）常配制SDS为100g/l，加入时据体系中总体积进行计算（100x=10×1.8,x=180ul→200ul±）4.在37℃裂解后，展现为高粘稠性半透明溶液，将试管内裂解液分装在两个1.5mlEP管中，约0.7ml±。取其中一管进行下一步试验，加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提（由黄色变为乳白色），于1转/min离心10min，将上层水相抽一入另一个EP管中，重复上述抽提一次，吸收上层水相于另一个EP管中，加入等体积氯仿：异戊醇=24：1，抽提一次，操作同前

核酸分离纯化技术第37页5.小心吸收上层水相，转移至另一个1.5mlEp管中，加入1/10倍体积NaAc及2倍体积无水乙醇。-20℃静置10min后观察沉淀（DNA）挑取出DNA沉淀加入70%乙醇1ml洗涤一次。1转离心2min.6.弃去乙醇，在室温下挥发干剩下乙醇，加入10mmol/lTE溶液50ul。溶解乙醇。7.-20℃保留。核酸分离纯化技术第38页①离心机②水浴锅③EP管④微量移液器仪器用具核酸分离纯化技术第39页第三节碱裂解法抽提质粒DNA

原理：在PH12.0-12.6碱性环境中，线性大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环（CC）质粒DNA仍为自然状态。将PH调至中性并有高盐浓度存在条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。大个别DNA和蛋白质在去污剂SDS作用下形成沉淀，而质粒DNA依然为可溶状态。经过离心，可将去除大个别细胞碎片染色体DNA，RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚、氯仿抽提深入纯化质粒

核酸分离纯化技术第40页主要试剂及作用：ˉSTE用于洗涤细胞。配制方法：

0.1mol/LNaC110mmol／LTris-C1（pH8.0）

1mmol/LEDTA溶液Ⅰ维持溶液pH值，抑制DNA酶。配制方法：50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-C1（pH8.0）10mmol/L

EDTA核酸分离纯化技术第41页溶液Ⅱ碱变性法主要试剂，使DNA变性，沉淀染色体DNA。配制方法：0.2mol/L

NaOH1%SDS溶液Ⅲ起中和作用。配制方法：

5mol/LKAc60ml

冰醋酸15ml

水28.5mlTE（pH8.0）（含无DNA酶RNA酶20ug/ml）溶解DNA沉淀。RNA酶能够水解RNA分子。核酸分离纯化技术第42页主要操作步骤：细菌培养及菌体搜集挑取琼脂培养板上单菌落，移至2-5mlLB培养液中（含适当抗生素）37C强烈摇荡过夜。取出1-1.5ml培养液移至eppendorf管中，1转离心30秒钟，弃上清，用1m1STE悬浮菌体沉淀，再离心回收菌体。再重复用STE，漂洗菌体，离心后，去尽上清液。搜集细菌后可选择以下方法提取质粒。核酸分离纯化技术第43页（1）将细菌沉淀悬浮于100u1冰预冷溶液I中，强烈振荡混匀s（2）加入200ul溶液Ⅱ，盖严管盖颠倒微型离心管5次以混合内容物，不要强烈震荡，放置冰上5分钟左右。（3）加入150u1溶液Ⅲ，能够将管盖朝下温和振荡10秒钟，冰水放置3分钟。（4）1转，4°C下离心5分钟，取上清移至1个新eppendorf管中。核酸分离纯化技术第44页（5）加入等体积酚／氯仿振荡混匀，1转，4°C下离心2分钟，取上清移至另一管中。（6）加入2倍容积乙醇（室温），振荡混匀．室温下放置2分钟（（7）1转4°C离心5分钟。核酸分离纯化技术第45页（8）弃上清，加入lrn170％乙醇振荡漂洗沉淀，1转4°C离心2分钟。（9）弃上清，用消毒滤纸小条小心吸净管壁上乙醇水珠，将管倒置放在滤纸上，室温下蒸发痕量乙醇几分钟。（10）加入20-50ulTE（pH8.0）（含无DNA酶RNA酶20ug/ml），溶解DNA，短暂振荡5分钟后可进行内切酶酶切试验或一20°C储存。核酸分离纯化技术第46页第三节真核细胞总RNA制备

怎样创造一个无RNA酶环境（关键）无所不在RNA酶：外源性RNA酶：RNA制备过程中用到玻璃和塑料制品、研究人员本身尤其是研究人员手，以及分离过程中用到试剂和溶液。内源性RNA酶：组织本身所固有，在一些组织中（如胰腺），或者在其特定生理状态（如快速发育期间）下含量很高。而且一当细胞破碎后即释放出来。核酸分离纯化技术第47页异硫氰酸胍法分离总RNA原理利用高浓度强变性剂异硫氰酸胍使细胞结构快速破坏，释放出RNA分子，经过酚／氯仿抽提即可得到总RNA。核酸分离纯化技术第48页材料及试剂1.无RNA酶水配制在三蒸水中加入0.1%DEPC，37℃放置12~16小时，高压灭菌30分钟，去除残留DEPC。核酸分离纯化技术第49页2.变性缓冲液使细胞结构破坏，释放RNA。4mol/L异硫氰酸胍25mmol/L柠檬酸钠0.85%十二烷基肌氨酸钠0.1mol/Lβ－巯基乙醇10%十二烷基肌氨酸钠3.2mol/LNaAc（pH4.0）为沉淀RNA提供Na＋。4.水饱和酚液（pH4.0）抽提RNA。核酸分离纯化技术第50页操作方法组织细胞匀浆、变性离心搜集培养细胞，用PBS缓冲液洗涤，4000r/min离心10分钟，去除PBS缓冲液，重复3次，加入变性液振荡至细胞裂解，液体变黏稠。核酸分离纯化技术第51页RNA抽提在上述裂解液中，加入1/10倍体积2mol/LNaAc、等体积水饱和酚、1/5体积氯仿∶异戊醇（49∶1）（每加一个试剂后均应充分振荡混匀），置冰浴15分钟，4℃、12000r/min离心20分钟，小心吸出上清，注意不要吸出富含蛋白质和DNA中间界面。再加等体积酚及1/5体积氯仿∶异戊醇（49∶1），颠倒混匀，4℃、12000r/min离心20分钟，小心吸收上清。核酸分离纯化技术第52页沉淀RNA

加入等体积异丙醇，－20℃沉淀1～2h。4℃、12000r/min离心20分钟，弃上清，沉淀用0.3ml变性液，重新混悬至沉淀完全溶解。加等体积异丙醇，混匀，－20℃1～2h，4℃、12000r/min离心20分钟，弃上清，用预冷75％酒精洗涤沉淀1～2次，将沉淀于室温晾干，溶于无RNA酶水中。核酸分离纯化技术第53页原理与蛋白质分子类似，DNA分子也是两性电离分子。在pH8.0～8.3时，碱基几乎不解离，磷酸基团全部解离，DNA分子带负电荷，在电场中向正极移动。但不一样大小和构象DNA分子电荷密度大致相同，在自由泳动时，迁移率区分很小，难以分开。采取适当浓度琼脂糖凝胶作为支持介质，发挥其分子筛效应，则可使分子大小和构象不一样DNA分子迁移率出现较大差异，从而到达分离目标。琼脂糖凝胶电泳核酸分离纯化技术第54页电泳后经溴化乙锭染色，在紫外光照射下DNA显橙红色荧光，可直接观察判断结果或照像。DNA在凝胶中迁移率与它分子量对数成反比，若将未知DNA迁移距离与已知分子大小DNA标准物电泳迁移距