单克隆抗体制备专家讲座

单克隆抗体制备Monoclonalantibody单个B淋巴细胞克隆所产生针对同一个抗原决定簇抗体。分三个阶段：（1）免疫Balb/c小鼠（2）建立筛选方法和程序（3）杂交瘤生成单克隆抗体制备专家讲座第1页一、动物免疫1Balb/c小鼠6-8周龄，25g左右，雌性较佳2免疫方法（1）首次腹腔免疫0.5ml抗原与福氏完全佐剂1：1混和液，普通2-3只鼠（2）30天后加强免疫，用福氏不完全佐剂单克隆抗体制备专家讲座第2页（3）15天后，尾静脉注射0.1mL水剂抗原，免疫3天后，去脾脏融合对于抗原性弱抗原，可增加免疫次数，详细程序依抗原性质而定。单克隆抗体制备专家讲座第3页可溶性蛋白（提取或表示蛋白）50-100μg颗粒性蛋白（病毒）50-100μg细菌106CFU活细胞（哺乳动物细胞）105-7CFU活癌源细胞104-6CFU糖类（多糖、糖蛋白）100-200μg核酸100-200μg单克隆抗体制备专家讲座第4页1在液氮罐中取保留SP2/0细胞，以MEM培养基复苏，37℃CO2培养箱中培养2在对数生长久收获107-108CFUSP2/0细胞3500g离心5min，弃上清4轻轻振动离心管以松动细胞，重悬于20mLMEM营养液中二、骨髓瘤细胞培养单克隆抗体制备专家讲座第5页注意关键点：1如细胞外观不健康，或生长密度不好，应检测是否有支原体污染2一次用一个冻存管里细胞融合，应防止长久培养3融合细胞要处于对数生长久单克隆抗体制备专家讲座第6页三、喂养细胞制备1取清洁级ICR小鼠2只，断颈椎杀死小鼠，置70%酒精溶液中浸泡10min2将小鼠四肢固定，腹部朝上3在生物安全柜内，无菌打开小鼠腹部皮肤4用20mL注射器吸收15mLMEM营养液，注入小鼠腹腔单克隆抗体制备专家讲座第7页5轻轻挤压小鼠腹腔，并用注射器往返抽吸几次，将小鼠腹腔内巨噬细胞吸出，置细胞瓶内待用6将喂养细胞转至50mL离心管内，500g离心5min，以HAT培养基重悬细胞，转至细胞培养瓶内待用单克隆抗体制备专家讲座第8页注意事项：1禁止用燃烧棉球对小鼠消毒2吸收腹腔喂养细胞时，不能将肠道刺破，否则会造成污染3如腹腔里脂肪块堵塞针头，应调整针头位置，重新吸收细胞液单克隆抗体制备专家讲座第9页四、脾细胞制备1取Balb/c小鼠2只，断颈椎杀死小鼠，置70%酒精溶液中浸泡10min2将小鼠四肢固定，腹部朝上3在生物安全柜内，无菌打开小鼠腹腔4小心分离出脾脏，置含有7mLMEM营养液培养皿内单克隆抗体制备专家讲座第10页5用针头刺破脾脏，并用弯针头挤压脾脏，将脾细胞分离出来6用吸管吹打细胞团块，将细胞悬液吸置50mL离心管中，沉降5min7将细胞悬液吸置另外一支离心管中，500g离心5min，弃上清，沉淀以20mLMEM培养基重悬单克隆抗体制备专家讲座第11页注意事项：1禁止用燃烧棉球对小鼠消毒2取脾脏时，假如脾脏被脂肪粘连，需小心，不能撕裂或撕碎脾脏，更不能将肠道撕破3假如脾脏没用肿胀，表明免疫效果不好，应选取备用小鼠脾脏单克隆抗体制备专家讲座第12页五、细胞融合及培养1以2：1混合脾脏细胞和SP2/0细胞，加至细胞融合管中2在室温下500g离心10min，弃上清3轻轻振动离心管以松动和混合细胞，后置37℃水浴4在60S内用巴氏吸管将0.8mL预热至37℃PEG1500迟缓加至细胞内，并轻轻抽吸两次单克隆抗体制备专家讲座第13页5在90S内，用移液管轻轻将30mL预热至37℃MEM培养基加至融合管中37℃水浴5min室温下500g离心10min，弃上清在融合管内加入HAT培养基20mL，将沉淀悬浮，后移置250mL玻璃瓶中，并加入HAT培养基30mL，后加入10-15mL喂养细胞悬液单克隆抗体制备专家讲座第14页9将细胞悬液加至96孔细胞培养板中，每孔2-3滴，约0.1-0.15mL10将细胞培养板置37℃饱和湿度CO2培养箱中培养11培养3天后可取出细胞板在倒置显微镜下观察细胞融合情况单克隆抗体制备专家讲座第15页12培养置第5天时用HAT培养基换液，换1/2137-8天用HT培养基换液，全部换液1410-14天后，杂交瘤细胞占孔底1/3以上，细胞上清变黄，能够检测融合细胞上清里抗体。单克隆抗体制备专家讲座第16页注意事项：1脾脏细胞与SP2/0细胞百分比在2：1—5：1最好2细胞融合是关键步骤，防止用力吸打3细胞融合后3天要注意检验是否污染，包含细菌和真菌，一发觉污染，要尽快弃去4换液时不要影响孔底杂交瘤细胞，不要吸出或冲散单克隆抗体制备专家讲座第17页六、杂交瘤细胞筛选大约有10%杂交瘤细胞能分泌抗体，而分泌特异性抗体杂交瘤细胞更少，故需要筛选。筛选抗体分泌细胞有各种方法，如HA-HI、IFA、ELISA等。其中间接ELISA应用最广。单克隆抗体制备专家讲座第18页注意事项：1因单抗是鼠源，故酶标识抗抗体惯用酶标羊抗鼠或兔抗鼠抗体，包含抗IgG、IgM抗体。如单用酶标识抗IgG抗体，则IgM类单抗就不能被筛选出来。2阳性克隆转移到24孔细胞培养板中，细胞长满后，上清再检测一次3筛选方法应在细胞融合前建立好，一部筛选特异单抗方法最好单克隆抗体制备专家讲座第19页七、杂交瘤细胞克隆在分泌特异性单抗杂交瘤细胞中，可能混有不分泌单抗细胞克隆；另外分泌单抗克隆在初代不稳定，有一部分细胞染色体常丢失，为了预防不分泌抗体细胞过分生长，在早期应对细胞进行克隆。惯用有限稀释法，普通来说，杂交瘤经过3-4次克隆后就稳定了。单克隆抗体制备专家讲座第20页1在克隆前一天，准备数块含有0.1mL喂养细胞96孔板2将24孔板里待克隆细胞悬浮，取0.1mL细胞悬液加入0.9mL台盼蓝染色液，混匀3血液计数板计数4在24孔培养板上，对待克隆细胞悬液进行10倍比稀释单克隆抗体制备专家讲座第21页5当稀释至100CFU/mL时，取1mL细胞悬液至装有10mLHT培养基瓶中，再分别加至96孔板中（预先加有喂养细胞），0.1mL/孔6将细胞培养板置37℃饱和湿度CO2培养箱中培养10天左右，注意观察7大约3-4天在倒置显微镜下可见细胞克隆，5-7天换液一次，810天左右克隆长满，能够检测上清单克隆抗体制备专家讲座第22页注意事项：1上清液要在24h内测定2细胞计数时只计活细胞（淡蓝色），死细胞为深蓝色，且没有光泽3如有高质量FCS ，可不用喂养细胞4一个克隆需亚克隆3-4次，才稳定5如有孔污染，可向感染孔及临近孔滴加1mol/mLCuSO4溶液单克隆抗体制备专家讲座第23页七、试验室规模抗体制备体外上清液培养1杂交瘤细胞先在25mL细胞培养瓶中培养2细胞长满瓶底后转至50或100mL细胞培养瓶中培养3当细胞液变黄后，搜集上清液，再加新鲜培养液，并重复搜集上清2次4让细胞长至饱和状态，直至死亡，并搜集上清单克隆抗体制备专家讲座第24页体内生产腹水1正常培养杂交瘤细胞2喂养Balb/c小鼠，注射细胞一周前经过腹腔注射0.5mL降植烷3在细胞对数生长久收获细胞，并进行计数，将细胞数量以培养液调整至（2-10）