蛋白质的提取与分离纯化生化实验设计讲解

蛋白质的提取与分离纯化生化实验设计讲解蛋白质的提取与分离纯化生化实验设计讲解第1页

已知某蛋白分子量约为17kDa，等电点3.9~4.1，它能耐一定高温，在90C加热3~4min后依然能够保持80%活性。该蛋白含有较多疏水性残基，与Ca2+结合后能够暴露它疏水基团。该蛋白作用是作为生物体内酶激活剂。请设计一个从脑组织中提取和分离纯化该蛋白试验方案，要求写出详细步骤和理由，以及检测方法。蛋白质的提取与分离纯化生化实验设计讲解第2页文件查得：钙调蛋白（CaM）是由148个氨基酸组成单链分子,其pI值在3.9-4.1之间,分子量约为17KDa.该蛋白能够耐一定高温，在90oC加热3-4min后依然能够保持80%活性。该蛋白分子中含有较多疏水性残基，与Ca2+结合后能够暴露出它疏水基团。蛋白质的提取与分离纯化生化实验设计讲解第3页整个试验过程普通可分为5个阶段：

①材料选择和预处理②细胞破碎（有时需进行细胞器分离）③提取④纯化（包含等电点沉降法，盐析，有机溶剂沉淀，吸附、层析、等）⑤分析判定。蛋白质的提取与分离纯化生化实验设计讲解第4页一、材料选定：大鼠脑组织预处理：将切取组织用4℃预冷0.01mol/lPBS漂洗去血渍，再用滤纸吸干残留PBS（磷酸盐缓冲液

）。试验步骤：蛋白质的提取与分离纯化生化实验设计讲解第5页二、a细胞破碎⑴机械方法主要经过机械切力作用使组织细胞破坏。常见器械有：①玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎）②高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动尖锐刀片），宜用于动物内脏组织破碎⑵物理方法主要经过各种物理原因作用，使组织细胞破碎方法。Ⅰ重复冻融法Ⅱ冷热变替法Ⅲ超声波法⑶化学及生物化学方法蛋白质的提取与分离纯化生化实验设计讲解第6页玻璃匀浆机蛋白质的提取与分离纯化生化实验设计讲解第7页b、细胞器分离

细胞器分离普通采取差速离心法。细胞经过破碎后，在适当介质中进行差速离心。蛋白质的提取与分离纯化生化实验设计讲解第8页

从破碎材料或细胞器提出蛋白质是不纯，需深入纯化。纯化包含将蛋白质与非蛋白质分开，将各种不一样蛋白质分开。选择提取条件时，就要考虑尽可能除去非蛋白质。普通总是有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质（如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后操作。常见有机溶剂提取除去。

三、蛋白质粗提取蛋白质的提取与分离纯化生化实验设计讲解第9页三、蛋白质粗提取原理：利用蛋白质在PH等电点时溶解度最小，因而会以沉淀方式析出。试剂：柠檬酸、磷酸氢二钠步骤：1．向试管中加入磷酸氢二钠和柠檬酸，使其PH=4。2．将提取溶液加入到第1步骤所配缓冲液中。3．静置一段时间，待沉淀完全。4．过滤或离心出粗产品。注意事项：预防局部过酸或过碱造成蛋白质变性。蛋白质的提取与分离纯化生化实验设计讲解第10页金属螯合亲和层析

固定化金属螯合亲和层析是建立在蛋白质表面氨基酸与固定化金属离子亲和力不一样来进行蛋白质分离一项技术。过渡态金属离子能够与电子供体，如氮、硫、氧等原子以配位键结合，金属离子上剩下空轨道是电子供体配位点，当它在溶液中会被水分子或阴离子占据。钙调蛋白外形似哑铃,有两个球形末端,中间被一个长而富有弹性螺旋结构相连,每个末端有两个Ca2+

结构域,每个结构域能够结合一个Ca2+,这么,一个钙调蛋白能够结合4个Ca2+,钙调蛋白与Ca2+

结合后构型相当稳定。四、精细纯化蛋白质的提取与分离纯化生化实验设计讲解第11页值得注意是，在洗脱时，会有少许配基与蛋白质一同被洗脱下来，所以常在其后加一凝胶层析以除去小分子配基。

凝胶层析法属最常见蛋白质分离方法。系混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相层析柱时，混合物中各物质因分子大小不一样而被分离技术。在洗柱过程中，分子量最大物质不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间空隙最先流出柱外。分子量最小物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速迟缓，致使最终流出柱外。

蛋白质的提取与分离纯化生化实验设计讲解第12页五、分析判定A、定性分析SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量：是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间二硫键断裂，蛋白质在一定浓度含有强还原剂SDS溶液中，与SDS分子按百分比结合，形成带负电荷SDS-蛋白质复合物，这种复合物因为结合大量SDS，使蛋白质丧失了原有电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然电荷差异，因为SDS与蛋白质结合是按重量成百分比，所以在进行电泳·时，蛋白质分子迁移速度取决于分子大小。蛋白质的提取与分离纯化生化实验设计讲解第13页当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质迁移率和分子量对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，

式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数若将已知分子量标准蛋白质迁移率对分子量对数作图，可取得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，依据它电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。蛋白质的提取与分离纯化生化实验设计讲解第14页B、定量分析紫外检测法、考马斯亮蓝法、Folin-酚试剂法（最常见方法）Folin-酚试剂法包含两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5～100μg蛋白质。Folin试剂