仪器和药物分析荧光质谱专家讲座

第二节光学分析一、原子吸收光谱二、紫外–可见分光光度法三、红外分光光度法四、荧光分光光度法五、有机质谱法仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第1页五、荧光分子光度法（一）基本原理（二）荧光分光光度计（三）特点、方法与应用仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第2页荧光（fluorescence）现象第一次统计：1575年，西班牙内科医生和植物学家N.Monardes，观察到LignumNephriticum木头切片水溶液展现天蓝色。第一次被提议用于分析：1864年，Stokes第一次用于分析：1867年，Goppelsröder依据Al-桑色素配合物荧光，建立了Al3+荧光测定方法。仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第3页当物质分子吸收了一定波长紫外光能之后，基态电子跃迁到第一激发态，处于激发态电子首先以无辐射方式下降到第一激发态低能级，而后再回到基态时，所发射出光称为荧光。荧光是一个以光能为激发源发射光，且波长比激发态波长更长，所以，利用物质荧光现象而建立分析方法称为荧光分光光度法。（一）基本原理仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第4页仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第5页荧光定量分析原理荧光是由物质在吸收光能之后产生发射光，其荧光强度与物质吸收光能程度和产生荧光物质相关。荧光效率φ——反应荧光强度主要参数荧光强度If应与荧光物质吸光强度(I0

－I

)和荧光效率φ成正比，即If=φ(I0

－I

)依据朗伯–比尔定律，和相关运算，在一定条件下，得：If=2.3φ

I0εcl=Kc

仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第6页（二）荧光分析光度计光源激发单色器样品池发射单色器检测器信号处理显示I0

IfI仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第7页荧光分光光度计部件1．光源：钨灯、汞灯、氙灯、激光激发光源应含有稳定性好、强度大、适用波长范围宽等特点。其中稳定性：影响测定重现性和精密度；强度：影响测定灵敏度。2．单色器：滤光片、光栅激发单色器和发射单色器3．检测器 PMTPhotomultiplier CCDChargeCoupledDevice CIDChargeInjectedDevice4．信号处理仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第8页JobinYvonFluorolog-3荧光光谱仪1.稳态：S/Nmin4000:1(光子计数和全反射光路)

2.10us-10s以上(磷光寿命)10ps-10us(荧光寿命)

3.波长范围：200-900nm(UV-VIS-NIR)

4.扫描速度：150nm/s仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第9页灵敏度高：比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级； 检测下限：0.1～0.1μg/cm-3 相对灵敏度：0.05-0.005ppb（0.05MH2SO4)选择性高重现性好取样量少仪器不复杂（三）荧光分析方法特点、方法及应用1．特点

仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第10页2．方法及应用

检测：金属离子、有机物、生物分子生物分子相互作用研究疾病诊疗定性分析：依据不一样结构物质所发射荧光波长不一样；定量分析：同种物质稀溶液，其产生荧光强度与浓度呈线性关系。分析方法直接荧光法（能产生较强荧光药品）间接荧光法（不能产生荧光或荧光很弱药品）仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第11页仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第12页仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第13页六、有机质谱法1.质谱基本知识质谱仪质谱分析原理质谱图2.离子峰主要类型3.有机质谱中裂解反应4.有机化合物普通裂解规律和常见质谱图仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第14页质谱法将化合物分子在高真空条件下，用高能电子轰击或强电场使其电离，电离产物按质荷比(m/z)大小进行分离统计所得图谱即所谓质谱图。基峰仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第15页高真空条件

10-4-10-6Pa质荷比质量/电荷分离聚焦电离电场或高能电子轰击(~70ev,~6,000KJ.mol-1)M＋e-→M

＋2e-

•

仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第16页（1）质谱计

质谱计须有进样系统、电离系统、质量分析器和检测统计系统。为了取得良好分析，必须防止离子和气体分子碰撞，凡有样品分子及离子存在和经过地方，都处于真空状态。进样系统电离系统质量分析器检测记录系统1.气体扩散2.直接进样3.气相色谱1.电子轰击2.化学电离3.场致电离和场解吸4.快原子轰击5.电喷雾电离1.单聚焦2.双聚焦

高真空系统仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第17页电子轰击利用高速电子束撞击气态分子，将分解出阳离子高速导入质量分离器中，按质荷比（m/z）大小次序搜集，并以质谱图统计下来，依据质谱峰位置进行定性和结构分析，或依据强度进行定量分析。化学电离高能电子束和小分子反应气体，甲烷等，反应生成初级离子，CH4+.，再和样品分子反应，使之电离。强致电离

电场作用下，汽化样品分子电离仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第18页场解吸不需要汽化，将样品吸附在处理过金属尖端，通以微电流，金属成为场离子发射体，使样品解吸，离子化。快原子轰击高能原子束轰击，采取基质负载样品，用于不稳定极性分子。电喷雾电离样品溶液在强静电场作用下形成带高度电荷雾状小液滴，溶剂不停挥发，液滴裂分，最终形成带电离子，可用于分子量大于0生物分子和络合物分析。仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第19页离子源重离子路径离子搜集器仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第20页离子源结构仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第21页（2）质谱分析原理

质谱仪是利用电磁学原理，使带电样品离子按质荷比进行分离装置。离子电离后经加速进入磁场中，其动能与势能相等，即(1/2)m

2=zU

质量为m,电荷为z正电荷离子，经外加电场U加速，离子运动速度为υ。在磁场存在下，带电离子按曲线轨迹飞行；

向心力=离心力；Hz

=m

2/R仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第22页质谱方程式：m/z=(H2R2)/2U离子在磁场中轨道半径R取决于：m/z、H

、U向心力=离心力；Hz

=m

2/R固定U值，将H由小到大连续改变,在狭缝搜集离子m/z比也由小到大地改变。仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第23页单聚焦质谱计双聚焦质谱计仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第24页各种峰表示不一样质/荷比离子；纵坐标以相对丰度表示，峰越高表示形成离子越多；（即谱图中以最强峰高为100%，分别计算其它峰强度）（3）质谱图基峰：质谱图中离子强度最大峰仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第25页六、有机质谱法1.质谱基本知识2.离子峰主要类型分子离子峰同位素离子峰碎片离子峰重排离子峰两价离子峰3.有机质谱中裂解反应4.有机化合物普通裂解规律和常见质谱图仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第26页（1）分子离子峰质谱信号十分丰富。分子在离子源中能够产生各种电离，即同一个分子能够产生各种离子峰，其中比较主要有分子离子峰、重排离子峰、碎片离子峰、亚稳离子峰等。试样分子在高能电子撞击下失去一个价电子，即

M＋e-→M

＋2e-

生成离子称为分子离子或母离子。其中“+”代表正离子，“.”代表不成对电子。•

分子离子质量与化合物分子量相等。仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第27页分子离子母离子奇电子离子碎片离子+.仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第28页质谱图上哪个是分子离子峰，哪个是基峰？思索！13057298710141仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第29页有机化合物分子离子峰相对强度：在质谱中，分子离子峰强度和化合物结构相关。环状化合物比较稳定，不易碎裂，因而分子离子较强。支链较易碎裂，分子离子峰就弱，有些稳定性差化合物经常看不到分子离子峰。芳香化合物＞共轭链烯＞烯烃＞脂环化合物＞直链烷烃＞酮＞胺＞酯＞醚＞酸＞支链烷烃＞醇．仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第30页M=93Ｎ律——分子中若含有偶数个氮原子，则相对分子质量将是偶数；反之，将是奇数。这就是所谓“氮律”。仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第31页比如：CH4M=1612C+1H×4=16M13C+1H×4=17M+112C+2H+1H×3=17M+113C+2H+1H×3=18M+2同位素峰分子离子峰（2）同位素离子峰（M+1峰）

因为同位素存在，能够看到比分子离子峰大一个质量单位峰；有时还能够观察到M+2，M+3…….；1615m/zRA13.1121.0133.9149.2158516100171.1m/z仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第32页（3）碎片离子峰

普通有机化合物电离能为7－13电子伏特，质谱中惯用电离电压为70电子伏特，过剩能量使分子离子化学键断裂，产生各种“碎片”离子。仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第33页H3CH3CC=O+·–CH3·CH3–C≡O+–COCH3+M+·=58m/z=43m/z=15碎片能够来剖析分子结构仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第34页常见丢失碎片常见稳定离子仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第35页（4）重排离子峰当分子中裂解为碎片离子时，在键断链同时，分子内部原子或基团重排，形成随片离子，这种离子产生质谱峰称为重排离子峰。仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第36页（5）两价离子峰分子受轰击后，失去两个电子，形成M2+离子，M2+离子产生质谱峰称为两价离子峰。一些杂环、芳环和高度不饱和化合物也易形成两价离子峰，而决大多数药品和毒物都有杂环和芳环结构。

除上述离子峰外，还可能有亚稳离子峰以及碎片与中性碎片反应形成离子峰等。对于一张未知化合物质谱图进行解析时，必须慎重、全方面考虑。仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第37页六、有机质谱法1.质谱基本知识2.离子峰主要类型3.有机质谱中裂解反应自由基引发裂解反应自由基引发重排反应4有机化合物普通裂解规律和常见质谱图生物质谱仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第38页α―裂解C-Y或C=Y（Y=O，N，S）基团化合物与这些基团相连化学键断裂。自由基或电荷定位在分子中某个特定位置上，然后以一个电子或电子正确转移来引发裂解反应。C价电子基本上都用于成键；O，N，S有非键电子（1）自由基位置引发裂解反应仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第39页α―裂解CH3(CH2)9CH2NH2M=15730α―裂解——丢失最大烃基可能性最大丢失最大烃基标准仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第40页麦氏重排（Mclaffertyrearrangement)位H

转移到杂原子上，同时

键发生断裂，生成一个中性分子和一个自由基阳离子（2）自由基位置引发重排反应键断裂同时有氢原子发生转移，产生重排离子；仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第41页六、有机质谱法1.质谱基本知识2.离子峰主要类型3.有机质谱中裂解反应4有机化合物普通裂解规律和常见质谱图烃类化合物裂解杂原子化合物裂解常见质谱图仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第42页（1）烃类化合物裂解优先失去大基团，优先生成稳定正碳离子。C6H5CH2+

CH2=CHCH2+

R3C+

R2CH+

RCH2+

CH3+稳定性仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第43页①直链烷烃正癸烷ΔM=14M-29CH3CH2CH2+CH3CH+CH3异构化生成稳定正碳离子仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第44页有m/z：29，43，57，71，……CnH2n+1系列峰ΔM=14M-29基峰为43或57仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第45页②支链烷烃CH3CH2CH2CH2CH3C+（CH3）2仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第46页③环烷烃环烷烃分子离子峰较强仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第47页仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第48页④烯烃41基峰是烯丙基正离子，M=41CH2=CHCH2+仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第49页⑤芳香烃仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第50页仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第51页仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第52页ΔM=14M-29基峰为43或57直链烷烃和支链烷烃质谱图有什么异同之处？支链烷烃有M-15环烷烃分子离子峰较强芳香烃苄基正离子普通是基峰（91）有苯环断裂特征峰77，65，37…..烯烃基峰普通是烯丙基正离子，M=41小结仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第53页特征：m/z=31+n*14;CH2=OH；出现M-18峰,失去一分子水；+（2）含杂原子化合物裂解醇，酚，醚类裂解仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第54页仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第55页M-18仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第56页仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第57页仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第58页苄醇：M-1峰比较强；m/z=79峰比较特征.苯酚质谱与苄醇会有什么不一样呢？基峰仪器和药物分析荧光质谱专家讲座第59页苯酚94峰强，77峰很弱。仪器和药物分析荧光质谱