多克隆抗体制备专家讲座

多克隆抗体制备多克隆抗体制备专家讲座第1页多克隆抗体制备方法动物选择动物免疫血清采集抗体纯化多克隆抗体制备专家讲座第2页动物选择一、选择制备多克隆抗体(抗血清)动物种类应考虑关键点:需要制备抗血清质量;供给蛋白质抗原动物与免疫动物之间种系关系;免疫动物产生抗体特征（针对不一样性质免疫原选取对应动物）。二、动物年纪、性别和数量反抗体制备影响优先选取青壮年动物；雌性动物免疫应答情况,不论是细胞性还是体液性免疫都比雄性个体强烈。多克隆抗体制备专家讲座第3页家兔家兔是最适合制备抗体动物。其体型适中,成年体重为2～6kg,一次采血量可达25～50ml,全放血量则达100～180ml;性格驯顺,易于操作和采血;寿命相对较长,为5～8年;能生产足够量高效价和高亲和力抗血清；通常适合用于制备抗啮齿类和人蛋白质抗体；家兔仅一型IgG而无亚型。用家兔IgG很轻易制备Fc、Fab和F(ab′)2等片段多克隆抗体制备专家讲座第4页鸡鸡种系距哺乳动物较远,用以制备抗哺乳动物蛋白质抗体含有独特优点。鸡IgG常称IgY,其特点是不会激活哺乳动物补体成份C1,也不会与细菌蛋白A或蛋白质G、哺乳动物Fc受体或类风湿因子等发生反应。在极端条件下,鸡IgY稳定性不如家兔IgG,不过,鸡IgY在鸡蛋内可保持稳定达数月之久,纯品IgY在中性缓冲液和冷藏条件下则可保留多年之久。用鸡IgY已经制备出Fc和单价Fab或Fab′等片段。鸡可将大量IgY输送入鸡蛋黄中,从鸡蛋中收获抗体可防止采取损伤性搜集伎俩。多克隆抗体制备专家讲座第5页免疫剂量剂量：免疫原适当剂量选定应考虑抗原性强弱、分子量大小和免疫时间。大动物抗原剂量（以蛋白抗原为准）约0.5～1mg/只，小动物约0.1～0.6mg/只。如无免疫佐剂可适当提升免疫剂量（10-20倍）。乳化：普通抗原与免疫佐剂体积比1:1混合。首次免疫采取完全佐剂，加强免疫采取不完全佐剂。（1）延长抗原释放时间；（2）增加抗原表面积；（3）佐剂能刺激吞噬细胞反抗原处理；（4）增强辅助T细胞作用；（5）刺激致敏淋巴细胞分裂和浆细胞产生抗体。使无免疫原性物质变成有效免疫原；（6）改变抗体产生类型以及产生迟发型变态反应，并使其增强。多克隆抗体制备专家讲座第6页免疫方式注射路径：免疫注射路径也很主要。普通采取多点注射，一只动物注射总数约为8～10点，包含足掌及肘窝淋巴结周围，背部两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，皮内易引发细胞免疫反应，对提升抗体效价有利多克隆抗体制备专家讲座第7页免疫方式间隔与免疫时间：第一次免疫后，因动物机体正处于识别抗原和b细胞增殖阶段，如很快接着第二次注入抗原，极易造成免疫抑制。普通以间隔10～20天为好。二次以后每次间隔普通为7～10天，不能太长，以防刺激变弱，抗体效价不高。免疫次数：依据抗体效价要求确定（抗血清滴度测定）多克隆抗体制备专家讲座第8页免疫应答机体免疫系统受到抗原刺激后，免疫细胞发生一系列改变，并产生一定免疫效应过程。(一)感应阶段(inductivestage)称致敏阶段(sensitizationstage)，是抗原物质进入体内，抗原递呈细胞(APC)对其识别、捕捉、加工处理和递呈，以及抗原特异性淋巴细胞(T细胞和B细胞)反抗原识别阶段。(二)增生分化阶段(proliferativeanddifferentiativestage)又称反应阶段(reactivestage)，是抗原特异性淋巴细胞识别抗原后活化，进行增殖与分化，以及产生效应性淋巴细胞和效应分子过程。T细胞增殖分化为淋巴母细胞，最终成为效应T细胞(或称致敏T细胞)，并产生各种细胞因子；B细胞增殖分化为浆细胞，合成并分泌抗体。一部分T、B淋巴细胞在分化过程中成为记忆细胞(Bm和Tm)。在此阶段，有各种细胞间协作和各种细胞因子参加。(三)效应阶段(effectivestage)此阶段是由活化效应细胞(CTL与TD或TDTH)和效应分子(抗体与细胞因子)发挥细胞免疫效应和体液免疫效应过程。这些效应细胞和效应分子共同作用去除抗原异物。多克隆抗体制备专家讲座第9页多克隆抗体制备专家讲座第10页首次应答(primaryresponse)机体首次接收适量抗原刺激后，引发体内抗体产生过程称为首次应答，主要特点为：①机体首次接触抗原后，需经一定潜伏期血清中才能出现抗体，潜伏期长短取决于抗原性质、抗原进入机体路径、所用佐剂类型、受体情况等，潜伏期之后为抗体对数上升期，抗体含量直线上升，然后为连续期，抗体产生和排出相对平衡，最终为下降期；②首次应答最早产生抗体为IgM，可在几天内到达高峰，然后开始下降，接着才产生IgG，IgG抗体产生潜伏期比IgM长，假如抗原剂量少，可能仅产生IgM，IgA产生最迟，而且含量少；③首次应答产生抗体总量较低，维持时间也短，通常以IgM为主，且抗体平均亲和力较低。

多克隆抗体制备专家讲座第11页再次应答(secondaryresponse)机体再次接触相同抗原时，体内产生抗体过程称为再次应答或回想应答(anamnesticresponse)，主要特点为：①潜伏期显著缩短，约为首次应答潜伏期二分之一；②抗体含量大幅度上升，比首次应答多几倍到几十倍，而且维持时间长；③诱发再次应答所需抗原剂量极小；④再次应答产生抗体主要为IgG，而IgM极少，抗体平均亲和力高。假如再次应答间隔时间越长，机体越倾向于只产生IgG。抗原物质如经消化道和呼吸道等粘膜路径进入机体，可诱导产生分泌型IgA，在粘膜表面发挥免疫