慢病毒简介专题知识讲座

慢病毒简介专题知识讲座慢病毒简介专题知识讲座第1页2慢病毒载体概况HIV-1基因结构慢病毒载体历史与构建重组慢病毒产生慢病毒在中枢神经系统中应用慢病毒在造血干细胞系统中应用慢病毒在眼科疾病治疗中应用慢病毒简介专题知识讲座第2页31.慢病毒载体概况慢病毒是逆转录病毒科亚科之一，分为灵长类和非灵长类慢病毒。灵长类慢病毒包含HIV-1，HIV-2，猴免疫缺点病毒（SIV），非灵长类慢病毒包含猫免疫缺点病毒（FIV），牛免疫缺点病毒（BIV），马免疫缺点病毒（EIAV）等，其中HIV研究最为透彻。研究表明慢病毒核蛋白质前整合复合物含有噬核特征，病毒基因组运输至细胞核，从而使慢病毒能够感染和在非有丝分裂细胞中复制。这一特征是慢病毒成为基因治疗转移载体。慢病毒简介专题知识讲座第3页42.HIV-1基因结构HIV-1为双链RNA病毒，共有9个基因。

gag基因编码病毒关键蛋白，包含基质蛋白、衣壳蛋白、核衣壳蛋白。pol基因编码病毒复制所需酶，如反转录酶、整合酶、蛋白酶。env基因编码病毒包膜糖蛋白，决定病毒感染宿主靶向性。rev编码蛋白调整gag、pol、env表示水平。tat编码蛋白参加RNA转录控制。4个辅助基因vif、vpr、vpu、nef编码蛋白则作为毒力因子参加宿主细胞识别和感染。两端为长末端重复序列(LTR)，内含复制所需顺式作用元件。编码病毒基础结构调整基因慢病毒简介专题知识讲座第4页53.慢病毒载体历史与构建3.1第一代HIV-1起源慢病毒载体以Naldini及Kafri构建三质粒系统为代表，该系统由包装质粒、包膜质粒及载体质粒3种质粒组成。包装质粒是HIV-1前病毒基因组5’端LTR由巨细胞病毒早期开启子取代，3’LTR由SV40polyA序列取代。包装成份分别构建在两个质粒上，一个表示gag和pol，另一个表示env。载体质粒携带了5’端LTR，和全部5’端非翻译区域，另外还带有rev应答元件（RRE）。包膜表示质粒使用水疱性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)用来代替了原病毒env基因。

慢病毒简介专题知识讲座第5页63.2第二代HIV-1起源慢病毒载体

1997年,Zufferey等将包装质粒上vif、vpr、vpu和nef基因(即辅助基因)敲除,从而得到,其它方面与第一代载体系统一致。

慢病毒简介专题知识讲座第6页73.3第三代HIV-1起源慢病毒载体为降低复制型病毒产生，可经过降低辅助质粒与载体质粒同源性，或者将gag/pol和rev编码序列隔离,分散在不一样质粒上。这么包装系统由四质粒代替原有三质粒包装系统。质粒一携带了gag/pol编码序列及RRE;

质粒二包含了编码rev序列;

质粒三是载体质粒;

质粒四表示env。慢病毒简介专题知识讲座第7页83.4本身失活型（SIN）慢病毒载体

SIN载体构建是在原病毒载体基础上删除了病毒3’端LTRU3区增强子和开启子序列片段。该区域出现突变则在HIV-1载体转录后，其5’LTR会因为缺失HIV-1所需要开启子和增强子序列而无法复制出完整长度病毒基因组。慢病毒简介专题知识讲座第8页94.重组慢病毒产生

常见瞬时转染法，即将包膜质粒，包装质粒和载体质粒共转染人胚肾293T细胞直接产生生产细胞。最终慢病毒分泌到培养基中进行培养而得到大量载体慢病毒。慢病毒简介专题知识讲座第9页10慢病毒在中枢神经系统中应用慢病毒简介专题知识讲座第10页111.IntroductionRecombinantviralvectorshavebeenusedtostudyavarietyoffundamentalissuesindevelopmentalneurobiology,aswellaspathogenesisandtreatmentsforvariousneurodegenerativediseases.Lentiviralvectorsarevaluabletoolsforneurobiologyresearchowingtotheirabilitytotransducenondividingcells,suchasneurons,andtointroducetherapeuticorreportergenesintocentralnervoussystem(CNS)cellsinvivoandinvitro.

重组病毒载体已被用于研究各种发育神经生物学中基础问题，以及各种神经退行性疾病发病机理和治疗。慢病毒载体能转导分裂细胞，如神经元，并介导中枢神经系统（CNS）细胞在体内和体外基因治疗或报道基因而作为神经生物学研究有价值工具。慢病毒简介专题知识讲座第11页121.1.LentiviralGeneDeliverytoCNSCellsLentiviruspreintegrationcomplexesinteractwiththenuclearporeandundergoactivetransportintothenucleusofnondividingcells,wheretheproviralDNAisintegratedintothegenomicDNAofthehostcell.Thisfeatureistheprimaryreasonwhylentivirusesarebeingdevel-opedasgene-transfervectorsforpostmitoticcellsintheCNS.

慢病毒整合前复合物与核孔相互作用进入细胞核分裂细胞，其中前病毒DNA整合到宿主细胞基因组DNA并进行主动运输。此功效是为何慢病毒在有丝分裂后细胞在中枢神经系统基因转移载体主要原因。慢病毒简介专题知识讲座第12页13Self-inactivating(SIN)vectorsreducetheprobabilityofoncogenesisbypro-moterinsertion.InSINvectors,viralpromoteractivityisdeletedfromtheinte-gratedprovirusbydeletionsintheU3regionofthe3’longterminalrepeat(LTR)thatarecopiedduringreversetranscriptiontothe5’LTR.

本身失活型（SIN）慢病毒载体3’端LTRU3区开启子发生失活突变后，在逆转录过程中转移至5’LTR。这么载体整合入靶细胞，将不会产生完整长度载体RNA，所以命名为“本身失活型载体”。慢病毒简介专题知识讲座第13页14Toincreasegenedeliveryinbrain,newergenerationsoflentiviralvectorsincorporatethecentralpoly-purinetract(cPPT),anapprox180bpregionderivedfromthegagregion,whichincreasesnuclearimportoftheproviralDNAandtransductionefficiencyinthebrain.

为了增加基因在脑中传递，新一代慢病毒载体包含cPPT，一个来自gag区约180

bp区域，从而增加了原病毒DNA进入核，也提升了在大脑中转导效率。慢病毒简介专题知识讲座第14页151.2.TargetedGeneDeliveryintheCNSUsingPseudotyped

LentiviralVectorsAnotherfeatureofthelentiviralvectorsystemisthatthevirionscancarryasurfaceproteinthatbypassestheusualHIVreceptorsandco-receptors,thuschangingorexpandingtherangeofcelltypesthatthevectorcanbindtoandenter.Thisisdonebypseudotyping,whichinvolvesreplacingtheHIV-1envelopeglycoproteinwithanenvelopeglycoproteinfromanothervirus,suchasthe

vesicularstomatitisvirusglycoprotein(VSV-G).

慢病毒载体系统另一个特征是携带病毒微粒表面蛋白，包含HIV受体和共受体，从而改变或扩充细胞类型范围，使得该载体能够结合而且进入。这个模型包括取代HIV-1包膜糖蛋白与另一个病毒包膜糖蛋白，如疱疹性口腔炎病毒糖蛋白（VSV-G）。慢病毒简介专题知识讲座第15页161.3.LentiviralVectorProductionThedevelopmentofstablepackagingcelllinesthatproducehightitersoflentiviralvectorshasbeenhinderedbythetoxicityofconstitutiveVSV-Gexpression.Forthisreason,manygroupscontinuetousetransienttripletransfectiontogeneratetheirvectorstocks.

产生高滴度慢病毒载体稳定包装细胞系发展受到VSV-G表示毒性妨碍。所以，大多数人使用三质粒系统。慢病毒简介专题知识讲座第16页17Threeplasmidsarerequired:encodingtheenvelopeglycoprotein(mostcommonlyVSV-G),

encodingthepackagingproteins(minimallyincludinggagandpol,oftenincludingtatandrevonthesameplasmid,andinsomecasestheaccessorygenesvif,vpr,vpu,andnef),encodingthegenome(includingtheintactorself-inactivatingLTR’s,thepackagingsignal,thepromoterandcDNAofinterestand,insomecases,posttranslationalregulatoryelementsandthecentralpoly-purinetract(cPPT),whichincreasetiterandexpression.慢病毒简介专题知识讲座第17页182.Materials

2.1.Transfection1.Ahighlytransfectablecelllinesuchashumanembryonickidney293T.2.Growthmediafor293Tcells.3.Poly-D-lysine.4.Boratebuffer.5.Reagentsforcalciumphosphatetransfection.慢病毒简介专题知识讲座第18页196.High-qualityplasmidDNA:transferplasmid,packagingplasmid,envelopeplasmidpurifiedthroughcesiumchloride/ethidiumbromideequilibriumcentrifugationorananion-exchangematrix.7.Polybrene,800μg/mLstocksolutioninPBS.8.LargepolyallomercentrifugetubesforconcentratingthevectorinaBeckmanSW28ul-tracentrifugerotor.慢病毒简介专题知识讲座第19页202.2.StereotacticSurgeryAnaesthesiamice.SurgicalPreparation.Drillingandinjection.Postoperativecare.Perfusion.AmanualforstereotaxicsurgerysuchasStereotaxicSurgeryintheRat.AmousebrainatlassuchasTheMouseBraininStereotaxicCoordinates.慢病毒简介专题知识讲座第20页213.MethodsTransfection转染CollectionandConcentrationoftheViralSupernatant

搜集和集中病毒上清TiteringLentiviralVectors

滴定慢病毒载体慢病毒简介专题知识讲座第21页22慢病毒在造血干细胞系统中应用慢病毒简介专题知识讲座第22页23造血干细胞（HSC）含有自我更新和分化为血液及免疫系统中各种成熟细胞能力，许多HSC疾病如遗传性、代谢性和感染性疾病或恶性肿瘤等有望经过基因治疗方法得到纠正。目标基因转移HSC后，可伴随HSC自我更新和分化在体内长久表示，所以HSC是较理想基因转移靶细胞。慢病毒简介专题知识讲座第23页24研究表明，VSV-G假构型HIV-I载体可不经过对HSC预刺激就能有效地将基因转移到人早期干细胞并能在重度联合免疫缺点(SCID)鼠骨髓中稳定地长久表示，Miyoshi等构建VSV-G假构型HIV-I载体，以绿色荧光蛋白（GFP）作为标识基因，将新鲜分离人脐血CD34+细胞在无血清及细胞因子培养基中转染5小时，然后植入经亚致死量照射非肥胖型糖尿病/重度联合免疫缺点(NOD/SCID)鼠，可在受鼠脾脏、骨髓及外周血GFP长久表示。慢病毒简介专题知识讲座第24页25MethodsIsolationofHumanCD34+HematopoieticProgenitorCells

人CD34+造血祖细胞分离PreparationofLentiviralVectors

慢病毒载体制备TransductionofCD34+CellsbyLentiviralVectors

慢病毒载体转导CD34+细胞AnalysisofTransducedHumanCD34+CellsinNOD/SCIDMice

分析转人CD34+细胞NOD/SCID小鼠慢病毒简介专题知识讲座第25页26慢病毒在眼科疾病治疗中应用慢病毒简介专题知识讲座第26页271.IntroductionTheprimaryaimofgenetransferintotheretinalcellshasbeentoinvestigatethedevelopmentalmechanismsoftheretinalcellsortoreverseretinaldiseases.Currently,lentivirusandadenoassociatedvirusvectorsarebeingusedforstudyingandcorrectinggenetherapyofretinaldegenerativediseases.

视网膜细胞基因转导主要目标是研究视网膜细胞发病机制或逆转视网膜疾病。

当前，慢病毒和腺病毒载体在被用于研究和纠正视网膜变性性疾病基因治疗。慢病毒简介专题知识讲座第27页28UsinganHIVvectorcarryingthegreenfluorescentprotein(GFP)geneexpressedfromthecytomegalovirus(CMV)p