目的基因的PCR扩增

一、试验目标

经过本试验学习PCR反应基本原理，掌握PCR基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。目的基因的PCR扩增第1页PCR（polymerasechainreaction)：聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。是一个体外扩增特异DNA片段技术。二、试验原理目的基因的PCR扩增第2页二、试验原理PCR用于扩增位于两端已知序列之间DNA区段，即经过引物延伸而进行重复双向DNA合成。基本原理及过程以下：PCR循环过程中有三种不一样事件发生：（1）模板变性（2）引物退火（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA延伸合成。目的基因的PCR扩增第3页二、试验原理1、变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双

链间氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。2、退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基

配对标准互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分

双链DNA，即退火阶段。3、延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单

链DNA为模板，在引物引导下，利用反应混合物中4

种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物延伸阶段。目的基因的PCR扩增第4页5’3’3’5’高温变性低温退火中温延伸不停循环聚合酶链式反应示意图目标片段模板引物对目的基因的PCR扩增第5页二、试验原理

上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中DNA量应该增加一倍，新形成链又可成为新一轮循环模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。

经典PCR反应体系由以下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成DNA引物、耐热DNATaq聚合酶。目的基因的PCR扩增第6页

PCR基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C二、试验原理目的基因的PCR扩增第7页二、试验原理目的基因的PCR扩增第8页二、试验原理目的基因的PCR扩增第9页PCR：变性－退火－延伸二、试验原理目的基因的PCR扩增第10页PCR二、试验原理目的基因的PCR扩增第11页二、试验原理目的基因的PCR扩增第12页温度（℃）时间（min）94726094℃变性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循环1循环2循环3PCR反应温度循环周期PCR反应每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成。图中设定反应参数是94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物数量满足试验需求为止。目的基因的PCR扩增第13页二、试验原理目的基因的PCR扩增第14页二、试验原理目的基因的PCR扩增第15页三、试验仪器与试剂1、仪器：PCR热循环仪、台式离心机、微量移

液器、吸头、电泳设备等。2、试剂：10xPCRbuffer、dNTPs（25mM）、Taq

酶（5u/μl）、引物1和2(10pmol/ul)、模板DNA、ddH2O、琼脂

糖、TAE电泳缓冲液、6×上样缓冲

液、溴化乙啶染液、等。目的基因的PCR扩增第16页四、试验步骤1、PCR反应普通在200ulPCR薄壁管中进行。2、反应体系（25µl）

ddH2O

18ul10xPCRbuffer（Mg2++）2.5ul

模板DNA1uldNTPs（25mM）1ul

引物1(10pmol/ul)

1ul

引物2(10pmol/ul)

1ulTaq酶(5U/l)

0.5ul25µl目的基因的PCR扩增第17页3、按下述循环程序进行扩增94℃×3分钟，1个循环94℃×30秒，56℃×30秒，72℃×1分钟，30个循环72℃延伸10分钟4℃保温4、扩增结束后取10μl扩增产物，利用1.2%琼脂糖

电泳检测DNA扩增情况

四、试验步骤目的基因的PCR扩增第18页五、试验结果目的基因的PCR扩增第19页六、PCR反应条件优化1、温度、循环参数：（1）变性温度和时间：确保模板DNA解链完全是确保整个PCR扩增成功关键。加热90～95℃，30～60s，再复杂DNA分子也可变性为单链。依据模板DNA复杂程度，能够调整变性温度和时间。普通情况下选择94℃30″，可使各种复杂DNA分子完全变性。温度过高或高温连续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。目的基因的PCR扩增第20页

（2）复性温度和时间：

PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板结合。复性温度选择，可依据引物长度和G+C含量确定，长度在15～25bp之间时，复性温度Tm=4(G+C)+2(A+T)计算得到，普通位于40～60℃，30～60s。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。普通情况下选择55℃30″，足以使引物与模板之间完全结合。六、PCR反应条件优化目的基因的PCR扩增第21页六、PCR反应条件优化

（3）延伸温度和时间：普通位于Taq酶最适作用温度70～75℃之间。引物小于16个核苷酸时，过高延伸温度不利于引物与模板结合，能够迟缓升温到70～75℃。延伸反应时间，可依据待扩增片段长度而定，<1Kb，1分钟足够；>1Kb需加长延伸时间，10Kb片段延伸时间可达15分钟。延伸时间过长可出现非特异扩增，惯用72℃1′。

目的基因的PCR扩增第22页

（4）循环数：其它参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA浓度。理论上说20～25次循环后，PCR产物积累即可到达最大值，实际操作中因为每步反应产率不可能到达100%，所以不论模板浓度是多少，20～30次是比较合理循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。六、PCR反应条件优化目的基因的PCR扩增第23页2、MgCl2浓度：

可显著影响PCR产量及产物特异性

1.5～2.0mM

过高：增加非特异扩增并影响产率过低：酶活性显著下降。

六、PCR反应条件优化目的基因的PCR扩增第24页3、引物：

0.2～1μM

偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间形成引物二聚体，产量降低。偏低：产量降低。引物设计标准：总标准是提升扩增效率和特异性六、PCR反应条件优化目的基因的PCR扩增第25页⑴长度15～30b，过短特异性降低，过长则成本增加，产量也下降。⑵引物碱基尽可能随机分布，防止出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物G+C含量宜在45～55%左右。⑶引物内部不能含有本身互补序列，不然会形成发夹样二级结构，两个引物之间尤其在3’末端不应有互补链存在，不然会形成引物二聚体。七、引物设计标准目的基因的PCR扩增第26页七、引物设计标准⑷引物碱基次序不应与非扩增区域有同源性(<70%)或少于连续8个互补碱基。要求在引物设计时采取计算机进行辅助检索分析。⑸引物5′末端碱基：并没有严格限制，只要与模板DNA结合引物长度足够，其5′末端碱基能够不与模板DNA匹配呈游离状态。最多可游离10个碱基并不影响PCR反应进行。目的基因的PCR扩增第27页⑹引物3′末端碱基：标准上要求引物3′末端与模板DNA一定要配对，另外3′末端末位碱基在很大程度上影响着Taq酶延伸效率。引物3′末端碱基在错误配对时不一样碱基引发效率存在很大差异，最好选T、G、C，而不选A。七、引物设计标准目的基因的PCR扩增第28页

因为PCR灵敏度非常高，所以应该采取办法以防反应混合物受痕量DNA污染。1.

全部与PCR相关试剂，只作PCR试验用，而不

挪作它用。2.操作中所用PCR管、离心管、吸管头等都只能

一次性使用。3.每加一个反应物，应换新枪头。八、注意事项目的基因的PCR扩增第29页1、PCR反应液中主要成份是哪些？在PCR反应过

程中各起什么作用？2、为何在PCR反应过程中，使用三个不一样温

度改变？3、用PCR扩增目标基因，要想得到特异性产物需

注意哪些事项？九、思索题目的基因的PCR扩增第30页引物设计总标准：扩增效率和特异性长度：15—30bp碱基尽可能随机分布（G+C含量45-55%）引物内部不能形成二级结构两引物间不应有互补链存在3’端一定要与模板严格配对5’端可引入突变，加酶切位点等辅助软件：Primer5，Oligo，DNAsis等引物Tm：DNA分子二分之一为单链，另二分之一为双链时温度称为该复合体溶解温度Tm，与G+C含量相关目的基因的PCR扩增第31页PCR引物设计AKPCDS554......2038引物15’GTCGCGGATCCATGTCACGGCCGAGAC3’BamH1CDS5’AGCTGTCATAAAGATGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCT…………….…………………….……………….…