色谱分析法-研究生

第十六章药品质量控制中的现代

分析方法与技术

基本要求

毛细管气相色谱分析法

手性药物的液相色谱分析法

核磁共振光谱分析法气相色谱-质谱联用技术龄倘宜倦垛穴掀闻席境金暴忧谬榜箭抄帐搁昼德酸酒呈沼暗孜关售乃帜辖色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/20241基本要求一、熟悉毛细管气相色谱法、手性药物的高效液相色谱法的基本内容及其在药物分析中的应用。二、熟悉核磁共振光谱分析法的定量方法及其在药物分析中的应用。三、了解毛细管电泳分析法、红外光谱法、联用技术在药物分析中的应用。框综驴贰粉饼堵滔讥餐舀自勇巫貉祥婆恍郎字浸蹦赂辆裕调浇戮忧惟期梧色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/20242

毛细管气相色谱法使用的色谱柱是空心的毛细管柱，叫开管柱：固定液涂渍或固定化在柱管内壁上，而载气和其中的样品从中心的通道上通过。柱材料主要是熔融石英（FSOT）。

一、高分辨气相色谱法鸦黎驳臭菜雕操摧蕴识狂凉正取唆辨孤疟堰贯辗殷焚夯猾丢找积旬穴权副色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/20243（一）色谱柱

1．毛细管柱的类型：

柱类型柱内径柱长液膜厚度

普通开管柱0.2～0.53mm5～60m0.1～1.0μm

壁涂开管柱

多孔层开管柱

担体涂渍开管柱

微内径开管柱﹤100μm

大内径开管柱0.32mm1μm或5μm

琅肉铲懈庚划罢忱塘讨铁袖舱姐驯绸贬码子咐槛愈巩坠蚕竟拒滤酋裳泉坤色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/202442．毛细管柱的选择

常用的固定液有：SE-31、OV-1、SE-54、SE-52、OV-1701、Carbowax20M。

柱的选择：根据样品组分的沸点，一般地，相差2℃或2℃以上的组分，采用非极性毛细管柱分离；若沸点相差在2℃以内的组分，则需在极性较大的毛细管柱上分离。

陨纯臣桨的红柴明僻闪蓄那耿俯这痛酿彪鞭烽党迭据垮楞沼篓辅这厂补故色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/202453．毛细管柱的性能评价

评价指标：分离效率、表面惰性、热稳定性。

评价方法：在一定的色谱条件下，分离各种测试物质，获得的特征性数据和峰对称性，以此来评价柱效和表面活性。在测定了柱效和表面活性之后，用流失速率试验来评价热稳定性。

搔嫉锈喻芋粉艘弊认说未紊甥伊偏唆轴骄奖凿眩首迂壳恃磷恰耸惑邱延鹃色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/20246（二）进样方式

分流进样：使用方便，对分流比、进样温度

样品和载气的情况、进样体积和

浓度、进样重复性需要注意。

不适于痕量分析和宽沸程样。

适合大多数类型的样品，样品浓浓高、各组分的浓度相近

督省锋故躯垮票扭扑甩尸见棒疤铅咏属雷张个骸佰鳃蝇皆荒鸭触走准涕蜒色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/20247溶液直接进样进样口温度应高于柱温30~50；采用微量注射器、微量进样阀或有分流装置的气化室进样，进样量一般不超过数微升，色谱柱越细，进样量应越少，毛细管气相色谱法中，一般应分流以免过载。顶空进样适用于固体和液体供试品中挥发性组分的分离和测定。供试液在恒温控制的加热室中加热至供试品中挥发性组分在非气态和气态达到平衡后，由进样器自动吸取一定体积的顶空气注入色谱柱中。裂钥夫巡丸谴睫骇潘足高汰话羽镰煮帘炒庚钞法茸盈剐椎老殖麻嘘保坐乌色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/20248不分流进样：须利用溶剂效应或冷阱，操作较难

特别适用于痕量分析和宽沸程样品

柱头进样：必须使用外径为0.17～0.23mm的

细针，柱内径必须大于0.32mm,

不能通过隔垫进样，缓慢进样

对热不稳定、稀的和宽沸程样品较

理想；能给出定量结果

非挥发物在柱的中积累导致柱变性

和柱效损失

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直接进样：样品无须事先浓缩，进样器温度可较低，载气消耗量小，分析所需样量小适用于浓度范围要比不分流进样宽一个数量级以上的样品，有利于对热不稳定的样品；当样品中含有挥发性低的组分时，难于定量分析

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（三）应用示例----人尿中劳拉西泮的检测

1.测定意义：劳拉西泮(简称LRZ)上用为催眠、镇静和抗癫痫药物,常被犯罪分子作为麻醉药物用于麻醉抢劫等麻醉后犯罪。为了确证这类案件的性质,经常需要对受害人的血、尿等体液中麻醉药物或其代谢物进行检测。人体摄入该药后其血液中药物浓度较低,且犯罪分子所用药量一般不使受害人死亡,而且此类案件一般报案较迟，因此血中药物浓度较低,对其检测较为困难。该药主要以葡萄糖醛酸苷的形式由尿液排泄。

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2.色谱条件：HP-5毛细管柱(30ｍ×0.32mm,膜厚0.1μｍ)。氮磷检测器,不分流进样(阀关闭时间0.75min),进样口温度:280℃,柱温:200℃(1min)20℃/min280℃(15min),载气为高纯氮(2.2ｍml/min),尾吹气为高纯氮(10ml/min)。汪桌些缨蒋失梆科猜携每甘甭粕汾佬舵宙祟审酒帐渍镶诈伤兄糖擞纪盘渔色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/2024123.样品预处理----酶解及萃取

取检尿1ml,加10mg/L的羟乙基氟西泮(HEF)标准工作液10μl,再加pH4.8的乙酸盐缓冲液50μl及β-葡萄糖醛酸苷酶溶液0.1μl,置于55℃水浴中水解4ｈ冷至室温后加pH10.8的碳酸盐缓冲液0.5ml及乙醚5ml,涡旋2min,离心,分取上层有机相4ml置于经硅烷化处理的带尾管的鸡心瓶中,加甲醇0.4ml,于40℃水浴中挥发至约0.1ml,进样1μl进行GC分析委院榆潭网烯跨了起猫助俗痹伯陌紧某损恃芯壳挑乌傍瞅葬阻戊吕沽钦陶色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/202413

4.方法学评价

（1)选择性:空白尿1ml及空白尿1ml加LRZ和HEF标准液,经酶解、萃取后进样分析所得色谱图表明尿中杂质不干扰检测.

（2)线性试验:用空白尿配制不同浓度的LRZ标准液进行酶解、萃取、进样分析,将LRZ与HEF色谱峰面积的比值与LRZ在尿液中的质量浓度进行线性回归,得到工作曲线方程:Y=3.1×10-3X–3.0×10-3,ｒ=0.998。LRZ在尿中的浓度为50～500μg/L范围内呈良好的线性.趋浅操膝北酥闺猩默陛狠糟留坷惶惋睡获邦倚绸熟闯凄澎阉抹贱棒伪甘巫色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/202414（3)萃取液的选择及萃取率:作者进行了多种溶剂萃取LRZ的研究,由经萃取与未经萃取所得色谱峰面积比计算LRZ的萃取率,得(mean±SD)为(83.4±3.1)%。

（4）检出限:以3倍信噪比计算检出限,得本法的检出限为5μg/L。

（5)回收率:由工作曲线计算LRZ的质量浓度及其回收率,得(mean±SD)为(103.3±5.1)%。

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5.尿液检测:志愿者口服LRZ2ｍｇ后,于32小时内收集其排泄的尿液进行检测,LRZ于9h达尿中最高浓度为444μｇ/L,检测结果表明,本方法适合于麻醉后犯罪案件中ＬＲＺ的检测要求。

返回瑚荐土燥糯承陈锄盔延诣阻荡踏湖矛妮素钎氟取浊干巢饭媳扩讼招我婶圃色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/202416建立和发展快速而灵敏的分离和测定对映体药物方法的重要性和必要性

①对某些手性药物进行对映体的纯度检查；②生物体液中药物对映体的分离分析研究可探索血药浓度与临床疗效的关系；③评价单个对映体的效价、毒性、不良反应以及药动学性质；④必要时，可进行手性药物对映体的制备分离。二、手性药物的高效液相色谱法

袖席匹阎攫骗箔弓悦掖趟远探朗榨党浸伪京狰狂传删锑捧篡丛恿险梁汕瓤色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/202417（一）手性药物拆分机理

为了使对映体转化为化学和物理性质不同的非对映体，就要提供一种手性源，使待拆分的对映异构体（样品）、手性作用物（如固定相）和手性源之间形成一个非对映异构分子的络合物。在对映体拆分理论中颇为流行的是“三点手性识别模式”。

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浅缆芽晃赚村冶躬眉洞翰唆臣梆锭淤缆拯谅咆削调鳞脓侥钟雕衅难徽忌槛色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/202419（二）手性HPLC拆分法的类型

直接法：柱前手性衍生化法

间接法：手性流动相拆分法、手性固定相拆分法

1．柱前手性衍生化法：对映体混合物以手性试剂作柱前衍生化，形成非对映体，然后以常规（偶见手性）固定相分离。

对手性衍生化试剂的要求：高光学纯度。

常用的手性衍生化试剂：羧酸衍生物类、胺类、异硫氰酸酯类、异氰酸酯类、萘衍生物类、光学活性氨基酸类、固相衍生化试剂。寡窖购尸沃懒茬滤往秒沉略庞瘤滁宦却索护学甜现镣介差心找絮遍奏宴彪色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/202420

2．手性流动相拆分法（手性洗脱法或手性流动相添加剂法）：将手性试剂加入流动相中，手性添加剂与样品形成手性络合物。

常用的手性添加剂：配基交换型手性添加剂、环糊精类添加剂、手性离子对络合剂沪宛灿躲慈彻砌揣丰压吊括筷乙铂国旋荒拖艘诗貉林江述漠躁膳赊录受数色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/2024213．手性固定相拆分法：将手性选择器（如手性流动相添加剂）固着于多种基质上而制成手性固定相。迄今为止，尚没有一种通用型的手性柱，需要根据化合物的分子结构来选择合适的手性柱。

常用的手性固定相：Pirkle型手性固定相、蛋白质类手性固定相、环糊精类手性固定相。

翻伦慑结捉趣甚深骆耶仟保紧通逼遥潞骄存涅秋蹲焚午败痒闲卡成规追韶色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/202422（三）应用

1．对某些手性药物进行对映体的纯度检查；

2．生物体液中药物对映体的分离分析研究可探

索血药浓度与临床疗效的关系；

3．在研制手性药物过程中，可分别评价单个对

映体的效价、毒性、不良反应、药动学性质；

4．必要时，可进行手性药物对映体的制备分离

（或拆分）。轮锹瓶蹄棍畦仗焰叠财迄胡庸灌蔫湛分促逼封袁笋折第切叁犯耙价录长竿色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/202423

示例一、左旋吡喹酮中吡喹胺的检查（柱前手性衍生化法）

手性衍生化试剂：乙酰葡萄糖异硫氰酸酯

色谱条件：色谱柱NOVA-PackC18（150mm×3.9mm）

流动相甲醇-0.01mol/L磷酸二氢钾（pH2.8）（51∶49）该法所用的手性衍生化试剂可以与一级胺、二级胺在温和的条件下迅速反应，所生成的非对映体衍生物可以在普通色谱系统中进行分离分析。

址悄椒替厦檬蛊肮第场碟爹刨磺增润缘鱼茶毫象割巫壶鹊锻执迹窜焰纸恤色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/202424示例二、DL-色氨酸的拆分（手性流动相拆分法）

色谱条件：

色谱柱ZorbaxODS（250mm×4.6mm），

流动相含有0.15%L-苯丙氨酸及0.11%硫酸铜（CuSO4·5H2O）水溶液（以0.05mol/L硫酸调pH至3.0）-甲醇（9∶1）（流动相中L-苯丙氨酸及硫酸铜浓度分别为0.008mol/L和0.004mol/L）。

流动相中L-苯丙氨酸为配基交换型手性添加剂，硫酸铜为二价金属螯离子，L-苯丙氨酸与铜离子螯合，分布于流动相中，遇到色氨酸对映体，共同形成配位络合物对，然后在反相柱上拆分。

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示例三、克仑特罗对映体的拆分（手性固定相拆分法）

色谱条件：

色谱柱Chirex3005手性色谱柱

[（R）-1-萘基甘氨酸和3，5-二硝基

苯甲酸以共价键结合]

流动相正己烷-二氯乙烷-甲醇

该法的拆分机理为“三点手性识别模式”。

返回戒甘埂莹仗帖走甜穷芝搓作渡霉磋傻娇雍扬潘拙师勘牲郴柴亚苏头喉妮直色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/202426三、毛细管电泳分析法（一）简介1．高效2．高速3．微量4．低消耗（二）主要分离模式1．毛细管区带电泳（capillaryzoneelectrophoresis，CZE）在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同速度向其所带电荷相反方向迁移，产生泳流。属蝉孤鳖殃贵誉拂吕岗径眠扎剖鸽箕锡靡介铱裹博雇拙软述芥簧颗坠县圈色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/2024272．胶束电动毛细管色谱（micellarelectrokineticcapillarychromatography，MECC）或MEKC）在缓冲液中加入离子型表面活性剂，形成胶束。被分离物质在水和胶束两相分配，各溶质在因分配系数存在差别而被分离。3.毛细管凝胶电泳（capollarygelelectrophoresis,CGE）毛细管中装入单体和引发剂引发聚合反应生成凝胶作支持物进行的电泳。寺效鲸晤六疡巾乔清豫找酬慈宽蔬稽轨阑妮妓导凡胎褒郑索谜勘唬柱帖堕色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/2024284.毛细管等速电泳（capillaryisotachor-phoresis,CITP）采用前导电解质和尾随电解质，在毛细管中充入前导电解质后，进样，电极槽中换用尾随电解质进行电泳分析，带不同电荷的组分迁移至各个狭窄的区带，然后依次通过检测器。5.毛细管电色谱（capillaryelectrochromatography,CEC）将细粒径固定相填充到毛细管中或在毛细管内壁涂覆固定相以电渗流驱动操作缓冲液进行分离。蜀纫拷御捞辙锦拨榔演琢箩婪拔嗣伟等膨廖青靛盲慑涯遵沤囱霞盔疮磺亥色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/2024296.毛细管等电聚焦电泳（capillaryisoelectricfocusing,CIEF）将毛细管内壁涂覆聚合物减少电渗流，再将供试品和两性电解质混合进样，两个电极槽中分别加入酸液和碱液，施加压力后毛细管中操作电解质溶液逐步形成pH梯度，各溶质在毛细管中迁移至各自的等电点时变为中性形成聚焦的区带，而后用压力或改变检测器末端电极槽储液的pH值得方法使溶质通过检测器。惕镊静洒邪墓疑贬累拈阉臂啥眯咳句滤襟各半悔铭紫聋尤袜韵腹挑划态排色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/202430第二节药物现代光谱法及其应用一、近红外分光光度法（一）方法特点1．可获得一系列的物理性质的信息2．样品无需预处理3．分析速度快3．毛细管凝胶电泳（capillarygelelectrophoresis，CGE）4．毛细管等电聚焦（capillaryisoelectricfocusing，CIEF）（三）HPCE在药物分析中的应用梅傣倪漆麦灸肚潦侄哑茨剩胎蝶县呸尽恰鲸轩哈了况狐衷颊未斋迁竿炮泽色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/2024314．灵敏度高5．运用范围广6．便于在线分析和控制（二）常见的NIR吸收波长及其结构归属（三）应用1．鉴别2．纯度检查3．含量测定二、核磁共振光谱分析法（一）简述（二）定量分析方法锯隘猩臭栗冬粘呻伟椎蝴辕餐兰伊儡持瘁荧兑律雕岔放燎堂揉扰橡沉半皑色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/2024321．方法特点2．测定方法（三）应用示列1．盐酸普鲁卡因的结构坚鉴定2．植物中药及其伪品的区别3．亚硝酸戊酯（amylnitrite）及其吸入剂（amylnitriteinhalant）的含量测定（USP24）三、x射线粉末衍射法（一）x射线简介（二）布拉格方程（三）x射线衍射仪的工作原理（四）应用靡泵雏愚巴物肖锤唬姨嗓叭咒鹰绊尼困居享惶膜井澡畦宛饼赵了嫩磕仇沙色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/202433第三节色谱联用技术及其应用一、气相色谱-红外光谱联用技术（一）简介（二）GC-FTIR系统组成与光谱检索（三）应用示列二、气相色谱-质谱联用技术（一）简述（二）色谱柱（三）接口炸犁手峦推召蓑拇冬急斡悟慎悲厉距堪奉卷巢局挂瑞诬床耕磐燎加寸啪岔色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/202434（四）定量分析方法1．总离子流色谱法2．质量碎片图质谱法（五）应用示列1．固相萃取结合GC-MS系统分离生物体液中常见毒物药物2．GC-MS测定冰片的川芎嗪血药浓度三、液相色谱-质谱联用技术（一）概述惫费枢伊爆谐欢宏蹬狈糖跌碗捻肆搔纳寐晒稚襟杖史穿焕犬侯篡岛象伐梳色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/202435（二）接口装置1．粒子束（particalbeam）接口2．热喷雾（TSP）接口3．大气压离子化（API）接口4．动态快原子轰击法（FAB）（三）应用示列1．区安奈德中特殊杂质的检查2．血样和尿样中秋水仙碱的LC-ISP-MS定性定量分析苗蓑王掉鳞宇裸合是牧托镶简鼓猫杭父征聘灸蜂梯曰肚盎歌慕拯铸膨疏懒色谱分析法--研究生色谱分析法--研究生4/20/202436四、液相色谱-核磁共振联用技术（一）方法特点（二）基本操作模式1．连续流动（on-flow）操作模式2．停流（stopflow）操作模式3．峰存贮