绵羊进行性肺炎抗体检测方法 琼脂免疫扩散试验

绵羊进行性肺炎抗体检测方法琼脂免疫扩散试验本标准规定了绵羊进行性肺炎(梅违-维斯纳病)抗体检测的操作方法和步骤。本标准用于检测绵羊进行性肺炎(梅迪维斯纳病)病毒抗体，适用于本病的检疫、诊断，疫情监测和流行病学调查。琼脂是一种含有硫酸基的多糖体，形成凝胶后呈多孔结构，孔径的大小取决于琼脂浓度。抗原和抗体的分子量一般都在20万以下，抗原及其特异性抗体在凝胶中从高浓度区域向低浓度区域扩散时受阻力很小，基本上呈自由扩散形式。由于不同抗原分子的分子量、结构、形状和电荷量不同，因此其扩散系数不同，在凝胶中的扩散速度也就不同。当抗原与相应抗体经扩散后在凝胶中相遇，形成抗原抗体复合物。若两者在相遇处比例适当，则形成最大的复合物。由于复合物的分子量增大，颗粒增大，因而不再继续扩散而产生沉淀，呈现出线状或带状的“特异性屏障”,称为免疫沉淀线或免疫沉淀带，因此，可根据抗原与标准阳性血清之间出现的这种沉淀线或沉淀带和抗原与被检血清之间是否出现沉淀线或沉淀带来判定被检血清中是否存在抗体。MV/OPP病毒最重要的抗原有两种，一种是病毒的囊膜糖蛋白，通常称为gP135;另一种为核心蛋白P28,制备这两种蛋白时收取感染细胞的培养液，经聚乙二醇透析浓缩50倍左右后获得的一种抗原制剂。以此抗原检测MV/OPP病毒抗体，特异性强，重复性好。从理论上讲，这两种抗原蛋白与其相应的阳性血清虚该成两条沉淀线，但试验结果证明，几乎所有的被检阳性血清只形成一条明显的沉淀线。3材料准备3.2MV/OPP琼脂扩散试验抗原、标准阳性血清：由OIE参考实验室或国家有关部门指定生产厂家或指定实验室提供，按说明书使用。3.3被检绵羊血清：按常规方法采血，分离血清，56℃水浴灭能30min。血清应无溶血、无细菌污染，保存于4℃。3.4器材；天平、吸管、量筒、平皿(规格为90.0mm×15.0am)、三角瓶、外径为5.3mm的七孔梅花样金属打孔器、微量移液器和微量吸头、观察灯、水浴钢、高压灭南锡等。4操作方法和步骤4.11%琼脂板的制备。4.1.1TrisHCl缓冲液的配制；见附录A。4,1.21%琼脂的制备：取TrisHCl缓冲液100mL加入琼脂糖1.00g,氯化钠8.50g,加热充分溶解，加0.01%叠氮钠，分装入试管，每管16mL备用。4.1.3制板：将试管内琼脂加热融化，待琼脂溶液自然冷却至约56℃时，将直径为90mm洁净灭菌的平血置于平台上，每个平皿加琼脂溶液16mL,使凝胶厚度达2.8mm。加盖待自然冷却凝固，把平皿倒2置湿盒中，4℃冰箱密封备用。4.1.4打孔：反应孔现用现打。从冰箱中取出琼脂板，立即按7孔一组(见图1)的梅花圆形打孔(中间1孔，周围6孔),或按25孔一组(见图2)的矩形打孔(中间行9孔，上下2行各为8孔),孔径5.0mm,孔距3.0mm,将孔中的琼脂轻轻挑出或吸出，勿伤边缘及使琼脂层脱离玻片，以免渗漏，可将打孔后琼脂板底部经酒精灯火焰上方快速来回5次～7次加热封底。制好孔型的平皿写上日期及编号。++4.2加样：使用图1时，用微量移液器吸取抗原悬液滴入中间孔；使用图2时，G孔加抗原。+孔加标准阳性血清，其他标有1、2、3……数字的孔分别加入被检血清，每孔加35pL～50pL,每孔均加满不溢出为度。每加一个样品应换一个滴头。4.3反应：加样完毕后，静止10min,将平皿例置，放入湿盒于室温(22℃~25℃)中孵育，24h初判，48h终判。5结果判定5.1判定方法将琼脂板置暗视野下观察，抗原孔与标准阳性血清孔之间出现一条清晰致密的白色沉淀线，则试验可以成立，否则视为无效，要更换试剂做重复试验。5.2判定标准5.2.1若抗原孔与被检血清孔间出现清晰致密沉淀线，并与标准阳性血清的沉淀线末端相连接，位置微向内侧弯曲时，则被检血清判为阳性(见图3)。5.2.2若抗原孔与被检血清孔间虽不出现沉淀线，但抗原与标准阳性血清孔间的沉淀线在被检血清孔位置微向内侧弯曲者，则被检血清判为疑似反应。对该份血清应复检，仍为疑似则判为阳性反应(见5.2.3若抗原孔与被检血清孔之间不出现任何沉淀线，且抗原孔与标准阳性血清孔间沉淀线直向被检血清孔或向其外侧偏弯者，则被检血清判为阴性(见图5)。5.2.4若抗原孔、被检血清孔之间的沉淀线与抗原孔、标准阳性血清孔之间的沉淀线交又，则判为非特异性反应，应重做。若仍出现非特异性反应则判为阴性(见图6)。6注意事项6.1加样时将孔加满为宜，切忌样品滥出。若溢出样品流入邻近孔时应重做。6.2所有样品加样完毕后，样品应暂放4℃冰箱内保存，待判定结果后如无复检必要时再废弃。6.3标准阳性血清避免反复冻融，以免降低效价影响检出效果。(规范性附录)Tris-HCI(三羟甲基胺基甲烷-盐酸)缓冲液的配制去离