牛及其产品中转基因成分实时荧光PCR检测方法

本标准规定了牛及其加工产品中转基因成分的实时荧光PCR检测方法。本标准适用于转人乳铁蛋白基因奶牛、转人a乳清白蛋白基因奶牛、转人溶菌酶基因奶牛及肉制品、奶制品等转基因成分实时荧光PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。bp:碱基对(basepair)。CMV;巨细胞病毒(eytomegalovirus)Cr;每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数(cyelethreshold)。dATP;脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosinettiphosphste)。dCTP₁脱氧胞苷三磷酸(deoxyeyticinetriphosphate)。dGTP₁脱氧鸟苷三磷酸(dcoxyguanosinetriphosphate),dTTP₁脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidinetriphosphate)。dUTP:脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridinetriphosphate)。DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleieacid)。GFP:绿色荧光蛋自(GreenFluorescentProtein)。hLA:人乳清蛋白(huamanlactobumin)。hLF;人乳铁蛋自(huamanlactoferrin)。hLY;人溶菌酶(huamanlysoeyme)。NPTⅡ;新霉素-3'磷酸转移酶基因(neomycin-3'-phosphotransferasegene)。SV40;薇猴空泡病毒40(SimianVacuolatingvirus40)。PCR₁聚合酶链反应(polymeraseTris:三(羟甲基)氨基甲烷(trishydroxymethylaminomethane)。24实验方法4.1主要仪器4.1.1实时荧光定量PCR仪。4.1.2超净工作台。4.1.3核酸蛋白分析仪。4.1.4高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机。除另有规定外，所有试剂均采用分析纯或生化试剂。4.2.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规定。4.2.3氯化镁(MgCl)。4.2.6其他药品及试剂配制方法见附录A。4.3引物和探针按照表1中提供的引物和探针序列合成引物及探针，加入无离子水配成100pmol/pl.贮存，配成直接用于PCR反应的10pmol/pL.的工作液。表1检测转基因动物内外基因所需的引物序列内源5'-CTGCTATGTGTATGGGGS°-GTAGAAAGACCAGTCCT内对照5*-TATGACTGGGCACAAC5*-CGTCTTGCAGTTCATTB'GTTCCGCGTTACATAACTTACGG5*-AAGTCCCTATTGGCGTTACTAC-3”GCTTGTCG-3”5°-TCACAAATTTCACAAATA5*-ACATGATAAGATACATTGA5*-GGATTTCTAATGCTCACTA5*-GCCTTTCTGGGTAATACT5*-TGTCATCAGTAATGTCATC5*-TGGGAGAGTGGTTACA4.4实验步骤4.4.1DNA提取与纯化DNA提取与纯化按以下步骤操作：a)取新鲜或冰冻动物组织块0,1g(0,5cm²),尽量剪碎。液氮研磨后转人1.5mL.离心管中，加入1ml.的组织裂解缓冲液，加入蛋白醇K(20mg/ml.)和胰RNA酶(20mg/mL)各5gl.,混匀，在65℃恒温水浴锅中水浴30min,也可转人37℃水浴12h～24h,间歌振荡离心管数次，于台式离心机以12000r/min离心5min,取上清液转入另一离心管中。b)加等量的酚1三氯甲烷1异戊醇振荡混匀·离心12000r/min.5min。e)取上层溶液至另一管，加入等体积的三氯甲烷，异戊醇，振荡混匀，离心12000r/min,5min。d)取上层溶液至另一管，加入1/10体积的3mol/LNaAc溶液(pH5.2)加入2倍体积的无水乙醇.混匀后室温沉淀2min,离心12000r/min,10min。e)小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。f)用1mL70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000r/min,5min。g)小心倒掉上清液，将离心管例置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。h)加100pl.TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或-20℃保存备用。4.4.2阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照：特测非转基因牛及其加工产品。阳性对照；含有待测基因序列的动物及其加工产品。空白对照；设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照《以水代替样品),二是PCR反应的空白对照(