输入性啮齿类动物携带钩端螺旋体的检测方法

本标准的附录A.附录B.附录C均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国新江出入境检验检疫局，中华人民共和国陕西出入境检验检疫局负责超草。本标准主要起草人：郑剑宁、叶仲华、杨定波、裘本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。输入性啮齿动物携带钩端螺旋体的检测方法 (规范性附录)啮齿动物采样操作方法小动物解剖固定板(蜻板或木板)、各种型号手术剪、手术锻子、小动物麻醉缸、二氧化碳麻醉装置、75%乙醇、乙醚、注射器及针头、毛细取血管。A.2操作方法将啮齿动物放入小动物麻醉缸用乙醚麻醉或放入二氧化碳麻醉装置用二氧化碳麻醉。A.2.2.1眼眶后静脉丛取血麻醉后，用左手拇指和食指抓住两耳间的头部皮肤，使头部固定、眼球充分外突，眶后静脉从充血。右手持玻璃毛细取血管(内涂抗凝剂),与而部成45°的夹角，经眼睑和眼球之间刺入眼球后部的静脉从。血液自动流入取血管。A.2.2.2眼眶取血麻醉后，用左手拇指和食指抓住两耳间的头部皮肤，使头部固定、眼球充分外突并固定，用眼科锻迅速将眼球摘除。将跟眶内流出的血液滴入离心管。A.2.2.3颈静脉或颈动脉采血动物麻醉后，仰卧固定于固定板上，剪去采血侧颈部被毛，纵向切开前颈部皮肤，分离颈静脉或颈动脉，用注射针向心方向刺入血管，抽取所需血量。也可剪断血管直接用容器取血。A.2.2.4断头取血准备好装血的容器，用剪刀剪掉啮齿动物的头，并立即将颈向下，提起尾部，血液即可滴入容器中。A.2.2.5左前肢腋窝下采血动物麻醉后，仰卧固定于固定板上，剪开左胸部皮肤，剥离皮肤与左前肢展开成袋状。剪开左前肢下静脉，用吸管或毛细取血管吸取血液。动物麻醉后，仰卧固定于固定板上，剪去胸部被毛，用75%乙醇消毒心区部。左手拇指和食指触摸心搏动处。右手持注射器，选择心搏动最强处间入。血液自动流入注射器。A.2.2.7腹主动脉采血动物麻醉后，仰卧固定于固定板上，沿腹正中线剪开腹壁，并用止血钳拉向两侧，纱布拭去渗出血液，将脏器推向一侧。在啮齿动物背下横一直径1.0cm~1,5cm的圆棒。分离出腹主动脉(呈浅红色有搏动感),在远心端向心方向刺入血管，迅速抽取血液。A.2.2.8股静脉或股动脉采血动物麻醉后，仰卧固定于固定板上，切开左或右腹股沟的皮肤，分离出股静脉或股动脉，将注射针向心方向刺入血管抽血。A.2.2.9尾尖采血动物麻醉后仰卧固定于固定板上或不麻醉直接将啃齿动物装入固定简内，露出尾巴。在需要取较多的血时，应将啮齿动物尾浸泡于45℃~50℃热水中，揩干后再剪去尾尖。小型嗜齿动物尾尖剪掉1.0mm~2.0mm或大型啃齿动物尾尖剪掉5.0mm~10.0mm,然后自尾根部向尖端按摩，血液自动5(规范性附录)显微镜凝集实验B.1主要器材普通恒温培养箱、实体显微镜、恒温水溶箱、高速离心机、5pL～50pL和50pL～200pL微量加样器。B.2培养基制备B.2.1Korthof培养基成分和制备蛋白胨(可用胰蛋白胨代替)氧化钠(NaCl)氧化部(KCD碳酸氧钠(NaHCO₃)磷酸二氧钾(KH₂PO)氧化钙《CaCl₂)20mg(如高压灭菌或煮沸后出沉淀，可省去此成分)B.2.1.2.1将以上成分溶于500mL纯化水中煮沸20min并过滤，校正pH为7.2,分装于烧瓶内，每瓶100mL,用103.43kPa高压灭菌30min。B.2.1.2.2兔血清56℃灭活30min。B.2.1.2.3将B.2.1,2.1液以无菌操作加入灭活兔血清，最后浓度为8%～10%。B.2.2Tepckmn培养基(硝酸盐缓冲溶液)成分和制备磷酸氢二钠溶液(Nn₂HPO₄·12H₂O)12g,加纯化水至500ml.。B.2.2.1.2磷酸缓冲液磷酸二氨钾溶液(KH₂PO₄)4.5g,加纯化水至500mL。B.2.2.2.1取母液80mL、磷酸缓冲液20mL,混匀，调整pH至7.2~7.4,加入纯化水900mL混匀，分装入试管，并用103.43kPa高压灭菌30min。B.2.2.2.3将B,2.2.2.1液以无菌操作加入灭活兔血清，最后浓度为8%~10%。B.3抗原制备将各群钩端螺旋体代表株于Korthof或Tepckmn培养基中，28℃培养5d~7d,暗视野显微镱检查，每400信视野下不少于50条，运动活泼并无自凝者可作显凝抗原。B.4操作方法及步骤B.4.1定性试验待检血清56℃水溶灭活30min后备用。用生理盐水以1150(或11100)和11500两个稀释度作定性试验，两个稀释度血清以及作对照用的生理盐水各取50pL,取各群代表株的培养液依次加入每列的三个孔中。摇匀后37℃孵育1.5h~2h.用接种环挑取反应液及对照，故置载玻片上暗视野显微镜下观察凝集情况。1:50《或1:100)和1:500稀释血清与某一群钩端螺旋体抗原发生凝集，进入B.4.2。未与任一群钩端螺旋体抗原发生凝集，则直接进入B.5。B.4.2测定凝集滴度(定量试验)B.4.2.1血清稀释按表B.1进行。阴性血清：无钩端螺旋体感染的啮齿动物血清；阳性血清：定性试验中与待检血清发生凝集的钩端螺旋体代表株免疫咕齿动物所获得的血清；标准抗原：与待检血清发生凝集的钩端螺旋体代表株的显凝抗原。123456789生理盐水/ml.阴性血清/mL.B.4.2.2对照标明10孔，11孔，12孔，第10孔加入阴性血清0.1mL,第11孔加入阳性血清0.1mL,第12孔加入生理盐水0.1mL。B.4.2.3加入抗原将各孔加入标准抗原0.1mL,混匀，各孔血清稀释度如表B.1所示。置37℃温箱2h,取出后摇匀，用接种环挑取各孔中的反应物置于藏玻片上，在暗视野下观察结果。B.5结果判定B.5.1定性试验结果判定待检血清末与任一群钩端螺旋体抗原发生凝集判定为阴性，发生凝集判为定性试验阳性，需进一步进行定量试验进行结果判定。B.5.2定量试验结果判定B.5.2.1几乎全部钩端螺旋体呈蝌蚪状或折光率高的团块，或有大小不等的点状或块状残片，仅有少75%的钩端螺旋体被凝集，大部分呈块状或蜘蛛状，尚有25%菌体游离判定为+++。50%左右的钩端螺旋体被凝集，尚有50%菌体游离判定为++。25%左右的钩端螺旋体被凝集，尚有75%菌体游离判定为+。全体菌体正常，分散，无凝集块，菌数与对照相同判定为一。B.5.2.2待检血清凝集效价在1:20达到“++”或以上时，均判为阳性反应。(规范性附录)将各群钩端螺旋体代表株于Korthof或Tepekmn培养基(培养基的制备同第B.2章),28℃培养5d~7d。生长良好的培养物用1000r/min离心30min,沉淀用PBS(见C.2.5)在相同条件下洗两次。沉淀用PBS悬浮，超声波打碎后，1000r常用以下两类酶结合物：——辣根过氧化物酶标记金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)。C.2.3.1阴性血清C.2.3.2阳性血清PBS(0,01mol/LpH7,4)含10%小牛血清的洗涤液。加至1000mL加至1000mL邻苯二胺(OPD)30%过氧化氢根据滴定的最适工作浓度，将特异性抗原用包被液稀释。每孔100pL,置37℃1h后，于4℃放置待