鸭病毒性肝炎Ⅰ型病毒血清中和试验

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准鸭病毒性肝炎I型病毒血清中和试验Serumneutralizationt2004-06-01发布中、华人民共、和国国家质量监督检验检疫总局鸭病毒性肝炎I型病毒血清中和试验本标准规定了鸭病毒性肝炎I型病毒血清中和试验操作方法。本标准适用于检测血清中的鸭病毒性肝炎I型病毒抗体。主要用于鸭病毒性肝炎的诊断及病原鉴定、免疫水平的监测和流行病学调查。下列缩略语适用于本标准。BME:Eagle'sBasalMedium细胞基础盐培养基。CPE:细胞病变。DEK:鸭胚肾细胞。DEL;鸭胚肝细胞。DHV-I;鸭病毒性肝炎I型病毒。FCS;胎牛血清。MEM,Eagle'sMinimalEssentialMedium组胞培养基。PFU₁空斑形成单位。TCID:半数组胞培养感染量。病毒感染敏感的细胞单层后，可以在细胞单层上生长增殖，并能产生CPE,使感染细胞圆缩、坏死并形成空班，血清中的特异性抗体能够抑制病毒在细胞单层上生长，血清抗体中和病毒的能力可以通过其阻止CPE产生的程度加以测定。本中和试验是应用固定病毒量雅释血清的方法，在DEL或DEK细胞单层上进行中和试验，用于鸭血清抗体的测定或病原的鉴定。4仪器设备4.1高压蒸气灭菌器。4.2可调移液器。4.3二氧化碳恒温培养箱。4.4倒置显微镜。4.5除菌过滤器。5材料准备5.1鸭病毒性肝炎I型病毒。5.2抗鸭病毒性肝炎I型病毒的阴，阳性血清，使用前均以56℃灭能30min后备用。5.3受检血清按常规方法采血并分离血清，使用前均以56℃灭能30min后备用。5.4溶液的配制；见附录A。5.5细胞培养板；选用无菌的孔径为5cm平底带盖塑料培养皿，或96孔平底带盖塑料培养板。5.6其他仪器：如剪刀、镊子、平皿、烧杯、三角瓶、刻度离心管、注射器、吸头等以112kPa高压灭菌30min,燃干后备用。5.7DEL细胞单层的准备：参见第B,1章。5.8DEK细胸悬液的准备：参见第B.2章。6血清中和空班减数试验6.1病毒毒价测定及配备取DHV-I用维持液将病毒液作10倍系列稀释，每个稀释度接种三个培养皿，按7.2.4和7.2.5的方法进行试验。取每个稀释度的三个培养皿的空斑平均数，用RcedMuench法计算病毒的PFU量，使用前配制成含200PFU/0.1mL的病毒悬液备用。6.2操作步骤6.2.1血清稀释及中和感作；分别取阳性血清、阴性血清、受检血清样品，用维持液作两倍系列稀释，每个稀释度加入等量病毒悬液，然后置37℃中和感作60min,每个稀释度接种三个培养Ⅲ。6.2.2细胞对照：设三个培养皿的正常细胞对照，加入维持液。6.2.3病毒对照：设三个培养皿的病毒对照，将上述使用的病毒悬液稀释为100PFU/0.1mL。6.2.4取已长满DEL细胞单层的细胞培养皿，吸去培养液，用维持液清洗两次，将上述稀释及感作好的泥合液移入细胞培养皿内，每个培养皿0.1mL,加盖后轻轻摇，使液体均匀分布于DEL细胞单层表面，然后置室温(20℃~22℃)感作30min。6.2.5每培养Ⅲ加入琼脂维持液3mL,加盖后，置37℃,3%～5%二氧化碳培养箱培养48h,取出后用偏光源(或低倍倒置显微镜)直接观察空斑的形成情况，或用10%的福尔马林固定后用1%的结晶紫染色观察空斑，并记录形成空案的数量。6.3结果判定6.3.1当细胞对照正常，阳性血清效价与原滴定的效价相差1个滴度以内，病毒对照的三个培养皿的平均空班数误差在10PFU以内时整个试验有效。6.3.2出现50%空斑减数的血清最高稻释倍数为该血清的抗体滴度。7微量血清中和试验7,1病毒毒价(TCID)测定及配备取DHV-I细胞适应毒用稀释液将病毒液进行10倍系列稻释，加人96孔墙养板内，每孔50pL,每个稀释度接种八个培养孔，然后每孔加入100μL的DEK细胞悬液，然后每孔补如稀释液50μL。加盖后，置37℃、3%～5%二氧化碳培养箱培养96h,取出观察并记录CPE,按Reed-Muenrh方法计算出病毒的TCID,使用前配制成含200TCIDg/50pL,的病毒悬液备用。7.2操作步骤7.2.1血清稀释及中和感作；分别取阳性血清、阴性血清、受检血清样品，用稀释液作两倍系列稀释，从稀释度114开始每个稀释度加入等量病毒悬液，稀释度112的加人等量的稀释液用作血清对照，然后置37℃中和感作60min。7,2.2将感作好的血清混合液加入96孔板内(第1～11孔),每孔100μl,每个稀释度需做4个孔，第12孔加入100μL的稀释液用作正常细胞对照然后每孔再加入100μL的DEK细胞悬液。7.2.3病毒对照设立：将病毒稀释为1000TCIDo/50pl.,100TCID/50pL,10TCID/50pL1TCID/50pL.每个船释度做4孔，每孔加入50pL,再加入100pL的DEK细胞悬液，每孔补加稀释液50pL。7.2.4置37℃,3%～5%二氧化碳培养箱培养96h,取出后在低倍倒置显微镜观察并记录CPE,或用10%福尔马林固定和1%的结晶紫染色后观察。7.3结果判定7.3.1当细胞对照和血清对照正常，阴性血清各孔出现CPE,阳性血清效价与原滴定的效价相差1个滴度以内，病毒对照的回归滴度与原测定滴度相差不超过104%5时，整个试验有效。7.3.2能够完全抑制病毒产生CPE的血清最高稀释倍数为该血清的抗体中和效价。7,3.3血清抗体效价在1:16以上(含1:16)判为阳性。5(资料性附录)原代细胞制备B.1DEL细胞单层准备选用来自健康种鸭群的14d～17d的鸭胚，用碘酒和酒精消毒蛋壳表面，打开气室，以灭菌镊子取出鸭胚，放在灭菌平Ⅲ内，剖腹取出肝脏(去除胆囊),放于烧杯内用Hank's平衡盐溶液冲洗三次，用灭菌剪刀剪碎，再用Hank*s平衡盐溶液冲决三次(加入溶液后让组织块自然下沉，再将溶液倒出),尽可能去除血液；然后加入5倍～10信于组织碎块的量的胰酶消化液，置37℃水浴消化20min,吸去胰酶消化液，加入细胞培养液洗涤两次，然后加入细胞培养液，轻轻吹打，使其完全分散(使肉眼不能看到组织碎块为止)。移入刻度离心管，以500r/min离心1min,取细胞泥，按每毫升含1.5×10°个细胞的比例用细胞培养液稀释，然后加入培养Ⅲ,每个培养皿5mL,加盖后置含5%二氧化碳的37℃培养箱培养。48h～72h长成细胞单层备用。B.2DEK细胞暴液的配备选用来自健康种鸭群的22d~25d的鸭胚，用碘酒和酒精消毒蛋壳表面，打开气室，以灭菌摄子取出鸭胚，放在灭菌平皿内，剖腹取出肾脏，放于烧杯内用Hank’s平衡盐溶液冲洗三次，用灭菌剪刀剪碎，再用Hank's平衡盐溶液冲洗三次(加入溶液后让组织块自然下沉，再将溶液倒出),尽可能去除血液；然后加