流式细胞检测技术讲座

关于流式细胞检测技术讲座主要内容

流式细胞技术概念流式细胞技术原理流式实验的设计流式细胞技术在临床&科研上的应用第2页,共46页，2024年2月25日，星期天流式细胞技术概述

流式细胞技术的概念流式细胞技术的特点流式细胞仪的检测范围

BD公司流式细胞仪流式细胞仪的结构第3页,共46页，2024年2月25日，星期天什么是FCM？流式细胞术：利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析及分选的技术激光技术+流体力学+光电测量技术+计算机技术+细胞荧光化学技术+单克隆抗体技术第4页,共46页，2024年2月25日，星期天FCM的特点测量速度快：最快可在1秒种内检测上万个细胞可进行多参数测量：可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量具有明显的统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况高分辨率(CV<2%)、高灵敏度(荧光检测灵敏度≤100MESF，前向角散射光检测灵敏度(0.2∼0.5um)既是细胞分析技术，又是精确的分选技术，分选纯度可达99%以上第5页,共46页，2024年2月25日，星期天流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞大小细胞颗粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体第6页,共46页，2024年2月25日，星期天BD公司流式细胞仪FACSCaliburLSRIIFACSCantoFACSCountFACSVantageFACSAria第7页,共46页，2024年2月25日，星期天流式细胞仪的结构光路：

1、激光光源及光束成形系统：

氩离子(488nm)

红色氦氖激光(633nm)

2、光学系统：透镜、滤光片、小孔液路——流动室及液流驱动系统（鞘流原理）信号检测与分析：光电倍增管(PMT)、补偿电路存储、显示、分析系统：计算机细胞分选系统

第8页,共46页，2024年2月25日，星期天流式细胞技术原理荧光发生机理及荧光光谱滤光片散射光信号的检测荧光信号的检测数据的储存与分析第9页,共46页，2024年2月25日，星期天荧光及荧光发生机理简介

荧光及荧光素：某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光波长长的光线——即荧光。受激发后能产生荧光的物质称荧光物质或荧光素荧光发生机理：室温下荧光素分子大部分处于“基态”，当荧光素在一定波长（激发波长）的光的照射下吸收光能后（经染色后的细胞在激光束的照射下），荧光染料吸收能量能级跃迁，进入新的状态，称为“激发态”，处于激发态的分子不稳定，它可以通过在10-9～10-7秒的极短时间内以发射一定波长的光量子的方式释放所吸收的能量从而返回到基态。这一过程称为荧光发射，也就是发光。第10页,共46页，2024年2月25日，星期天荧光素的激发和发射光谱

任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱

激发光谱（Excitation，Ex）：

是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。吸收波峰（最大吸收波长）：Ex-Max

发射光谱（Emission，Em）：

是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光发射波峰（最大发射波长）：Em-Max

荧光素的使用：

选择正确的激光器确定所需荧光探测器（PMT）488nm520nm异硫氰酸荧光素（FITC）第11页,共46页，2024年2月25日，星期天LongpassShortpassBandpass460500540460500540475500525SP500LP500BP500/50光学系统：滤光片置于荧光探测器前，限定其接收的荧光的波长范围第12页,共46页，2024年2月25日，星期天荧光光谱示意图第13页,共46页，2024年2月25日，星期天第14页,共46页，2024年2月25日，星期天散射光信号FSCSensorLaserSSCSensor第15页,共46页，2024年2月25日，星期天散射光信号RightAngleLightDetector

CellComplexitySSCForwardLightDetector

CellSurfaceArea

FSCIncidentLightSource前向角散射光（FSC,ForwardScatter）

反应细胞相对大小及其表面积

侧向角散射光（SSC,SideScatter）

反应细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性第16页,共46页，2024年2月25日，星期天外周全血细胞散射光双参数点图

（红细胞溶解后）第17页,共46页，2024年2月25日，星期天第18页,共46页，2024年2月25日，星期天流式细胞仪的荧光检测信号荧光信号使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量第19页,共46页，2024年2月25日，星期天数据分析

数据存储:LISTMODE

数据显示:

直方图(Histogram)

二维点图(DotPlot)

等高线图(ContourPlot)

密度图(Density)

三维图（3DPlot）等第20页,共46页，2024年2月25日，星期天数据分析直方图分析第21页,共46页，2024年2月25日，星期天点图分析数据分析第22页,共46页，2024年2月25日，星期天数据分析等高图和密度图分析第23页,共46页，2024年2月25日，星期天数据分析三维图分析第24页,共46页，2024年2月25日，星期天第25页,共46页，2024年2月25日，星期天流式实验设计原则常用荧光标记探针常用仪器荧光通道分布实验对照、同型对照、补偿对照荧光与抗体的搭配小结第26页,共46页，2024年2月25日，星期天常用的单克隆抗体荧光标记探针488nm激光激发：FITC（异硫氰酸荧光素）：荧光强度可受pH的影响，当pH降低时其荧光强度也随之减弱PE（藻红蛋白）PerCP（多甲藻叶绿素蛋白）：光量子产量并不太高，最好应用在检测表达较高的抗原上PerCP-Cy5.5（叶绿素蛋白偶联物）PE-Cy7（藻红蛋白偶联物）PE-Cy5（藻红蛋白偶联物，又称Cy-Chrome）PE-TexasRed（藻红蛋白-德州红偶联物，又称ECD）633nm激光激发：APC（别藻青蛋白）APC-Cy7（别藻青蛋白偶联物）第27页,共46页，2024年2月25日，星期天常用的核酸荧光标记探针PI（碘化丙啶）：可嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中，主要用于对DNA染色，使用时需用RNase对细胞进行处理；不能透过活细胞膜对核酸染色，可用于鉴别活死细胞，对活细胞染色时需对细胞膜打孔，以便染料透过。488nm激光激发，发射光谱宽泛550～725nm，可与PE共用通道TO（噻唑橙）：可用于对网织红细胞中的RNA进行检测定量分析，TO的荧光强度与RNA含量由良好的线性关系，对细胞膜的通透性好，可直接对活细胞染色，488nm激发，可发射出530nm荧光，可与FITC共用通道第28页,共46页，2024年2月25日，星期天常用荧光素激发、发射、光源波长

以及适用机型第29页,共46页，2024年2月25日，星期天FACSCalibur光学滤片检测器组（激光器）PMT位置带通/长通透镜适用染料488nm蓝色激光FL1530/30FITCFL2585/42PE,PIFL3670LPPerCP,PerCP-Cy5.5PE-Cy7635nm红色激光FL4661/16APC第30页,共46页，2024年2月25日，星期天FACSCanto光学滤片检测器组（激光器）PMT位置带通/长通透镜适用染料八角形（488nm蓝色激光）A780/60PE-Cy7B670LPPerCP-Cy5.5,PerCPC585/42PE,PID530/30FITC三角形（633nm红色激光）A780/60APC-Cy7B660/20APC第31页,共46页，2024年2月25日，星期天FACSAria光学滤片检测器排列（激光器）光电倍增管BP滤光片

可用染料八角形（488nm蓝色激光）A780/60PE-Cy7B695/40PerCP-Cy5.5,PerCPC610/20PE-TexasRedD575/26PEE530/30FITC三角形（633nm红色激光）A780/60APC-Cy7B660/20APC三角形（407nm紫色激光）A530/30AlexaFluor430B450/40CascadeBlue,PacificBlue,DAPI,Hoechst,AlexaFluor405第32页,共46页，2024年2月25日，星期天荧光染色对照阳性对照使用已知阳性样本，帮助排除试剂的质量、浓度、特异性以及染色方法等因素阴性对照空白对照（自发荧光）自发荧光，即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。自发荧光信号为噪声信号。一般说来，细胞成分中能产生自发荧光的分子（核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强，如肿瘤细胞、粒细胞等；样本死细胞比例越高，自发荧光越强。实验样本（自发荧光＋特异荧光＋非特异荧光）特异荧光，即抗体F(ab’)2段与细胞抗原特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光非特异荧光，即抗体Fc段与细胞表面的Fc受体非特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光同型对照（自发荧光＋非特异荧光）第33页,共46页，2024年2月25日，星期天同型对照同型对照（IsotypeControl）：与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型与染色的单克隆抗体①相同种属来源②相同免疫球蛋白及亚型③相同荧光素标记④相同剂量和浓度⑤但由未免疫动物血清纯化而来用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体而产生的背景染色例如，标记FITC的单克隆抗体为小鼠IgG1亚类抗体，标记PE的单克隆抗体为小鼠IgG2a亚类抗体，同型对照应用相同浓度和剂量的未免疫小鼠血清的纯化IgG1（γ1）和IgG2a（γ2a），并分别标记FITC和PE第34页,共46页，2024年2月25日，星期天荧光染色补偿对照的设置补偿对照（双色或多色分析时）荧光补偿（compensation）是指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠（spectraloverlap）的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号将单种荧光素标记的单克隆抗体分别进行单色荧光染色

※几色分析就需要制备几个补偿对照管设置补偿的基本步骤：①上同型对照管，调节PMT电压，使阴性细胞群体处于双荧光散点图的左下角101道以内；②分别上单阳补偿管，依次调节相邻荧光的补偿设置，直至阳性和阴性细胞群处于最合适的位置第35页,共46页，2024年2月25日，星期天双色荧光补偿第36页,共46页，2024年2月25日，星期天双色荧光补偿第37页,共46页，2024年2月25日，星期天双色荧光补偿第38页,共46页，2024年2月25日，星期天双色荧光补偿第39页,共46页，2024年2月25日，星期天实验设计实例分析类型管功能

加入的抗体单色分析1Isotypeγ1-FITC2Sample1,2……A-FITC双色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PE2Compensation1A-FITCγ2a-PE3Compensation2γ1-FITCB-PE4Sample1,2……A-FITCB-PE三色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PEγ1-PerCP2Compensation1A-FITCγ2a-PEγ1-PerCP3Compensation2γ1-FITCB-PEγ1-PerCP4Compensation3γ1-FITCγ2a-PEC-PerCP5Sample1,2……A-FITCB-PEC-PerCP四色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PEγ1-PerCPγ1-APC2Compensation1A-FITCγ2a-PEγ1-PerCPγ1-APC3Compensation2γ1-FITCB-PEγ1-PerCPγ1-APC4Compensation3γ1-FITCγ2a-PEC-PerCPγ1-APC5Compensation4γ1-FITCγ2a-PEγ1-PerCPD-APC6Sample1,2……A-FITCB-PEC-PerCPD-APCNo.AntibodyIsotypeMouseanti-human未免疫Mouse血清纯化而来1A-FITC（γ1）γ1-FITC2B-PE（γ2a）γ2a-PE3C-PerCP（γ1）γ1-PerCP4D-APC（γ1）γ1-APC第40页,共46页，2024年2月25日，星期天荧光抗体组合的选择用不同颜色的荧光素标记不同种类的单克隆抗体，可以在一个细胞上同时分析多种抗原分子，但并非各种荧光抗体均可以自由地组合在一起，在确定组合选择之前，还必须考虑到一些影响因素流式细胞仪的类型及荧光光谱选择适当强度的光源作为荧光物质的激发光源，并选择适合于被检荧光物质选择性吸收的光谱滤光片接收荧光了解不同抗体的细胞反应谱，以及染色模式根据不同的实验目的选择抗体。因为相同CD编号的抗体可能识别不同的抗原决定簇。如CD45RA表达在幼稚/静止T淋巴细胞，而CD45RO表达在记忆/活化T淋巴细胞。胞膜和胞内染色：通常，先胞膜染色，固定，膜通透和胞内染色，最后是DNA染色。第41页,共46页，2024年2月25日，星期天荧光抗体组合的选择3.抗体结合荧光素的荧光强度

每一种荧光素的相对荧光强度都不一样。一个特定抗体，能否区分阴性与阳性结果，即有较好的S/N比值，取决于该抗体用何种荧光素标记。荧光素相对强度也与仪器有关，这是由于不同仪器使用的激光和滤光片组合不同，因此造成了荧光强度的差别。下面列出了一般情况下，不同荧光素的相对强度的大小顺序，某些个别的单克隆抗体的荧光标记情况会有所不同。

APC>PE>PerCP-Cy5.5>FITC>PerCP

4.抗原密度

高表达的抗原几乎可以用任何荧光素标记的抗体检测，而较低表达的抗原（如细胞因子）则需要用较高S/N比值的荧光素（如PE和APC）标记的抗体检测，从而达到有效区分阳性细胞群和阴性细胞的目的。如血小板活化检测试剂：

PAC-1-FITC/CD62P-PE/CD61-PerCP第42页,共46页，2024年2月25日，星期天荧光抗体组合的选择5.荧光光谱之间的重叠在多色分析中，虽然可以通过荧光补偿消除荧光光谱重叠的影响，但使用荧光探针的种类越多，补偿的复杂程度增加，因此选择光谱重叠越少的组合越好6.自发荧光每个细胞群体的自发荧光水平都不同，自发荧光在高波长范围里（>600nm）迅速降低。因此检测自发荧光水平高的细胞时，使用发射光波长较长的荧光染料（如APC），可得到较好的S/N比7.荧光素浓度、配伍不当、试剂的质量均导致假阴性/