TRAIL联合顺铂诱导骨肉瘤HOS-8603细胞凋亡研究(全文)

精品文档-下载后可编辑TRAIL联合顺铂诱导骨肉瘤HOS-8603细胞凋亡研究(全文)【摘要】目的研究TRAIL联合顺铂诱导HOS-8603细胞的凋亡及其机制。方法MTT法分别测定TRAIL，顺铂，和TRAIL+顺铂对HOS-8603细胞的抑制率，流式细胞法测定亚G1期细胞百分率及PI和Rh123双染色后细胞的ΔΨm。结果三组分别由TRAIL、顺铂、TRAIL+顺铂处理过的HOS-8603细胞用MTT法测抑制率分别为29%、33.6%、58.5%。随着药物作用时间增加,HOS-8603细胞凋亡数增加和ΔΨm降低(P

【关键词】TRAIL；顺铂；细胞凋亡

骨肉瘤是一种相对耐药的肿瘤,单药化疗的效果一直不很理想。联合化疗多以铂类药物为主。TRAIL是INF超家族成员，能选择性杀伤肿瘤细胞。本实验旨在探讨TRAIL与铂类药物联合化疗方案的可行性，为骨肉瘤的临床治疗提供参考。

1资料与方法

1.1实验材料HOS-8603细胞株购自中国医学科学院药物研究所;TRAIL、顺铂、CsA均购自Sigma公司(化学纯标准品)。主要器材：流式细胞仪型号:EPICSALTRAⅡ.AmericanBeckman;荧光酶标仪型号:GENIOSVA200,AUSTRIATECAN。

1.2药物配制将TRAIL用生理盐水溶解并分别配制成10ug/ml和50ug/ml两种浓度的储藏液。将顺铂、CsA分别用生理盐配制成10ug/ml的储藏液,备用。

1.3凋亡细胞荧光染色HOS-8603细胞以1×106接种于六孔板培养,加入不同浓度的TRAIL+顺铂,培养24h后,经DHanks液洗涤及荧光染料Hoechst33258和PI，37℃避光染色10min，洗涤后在荧光显微镜下观察细胞形态及颜色改变。

1.4透射电镜观察1000r/min,离心10min收集处理后的HOS-8603细胞,经固定、脱水、包被及乙酸双氧铀和枸橼酸铅双染色处理后透射电镜观察细胞形态。

1.5MTT法测定TRAIL，顺铂，TRAIL+顺铂对HOS-8603细胞生长的影响取对数生长期HOS-8603细胞,以2×106/ml的细胞浓度,接种于上述三种药物处理培养基中,以生理盐水为空白对照组。将每种药物组分两组,其中一组在加药物前30min加入终浓度1.0μg/mlCsA［10,11］,每组设3个平行对照孔。

1.6细胞DNA含量分布测定取药物处理12，24,36,48h后HOS-8603细胞,经固定、染色后流式细胞仪测定DNA。

1.7细胞ΔΨm检测参照文献［1,2］,取上述三种药物处理12,24,36,48h后的HOS-8603细胞,经DHanks液洗涤后用10ug/mlRh123在37℃避光染色30min,再次洗涤后用10ug/mlPI在37℃避光染色20min,流式细胞仪检测。

1.8统计学方法用SPSS统计软件包作方差分析对各组作显著性检验，TRAIL组与TRAIL加CsA组采用配对t检验，以P

2结果

2.1HOS-8603细胞分别经2.5ug/mlTRAIL，1.0ug/ml顺铂，2.5μg/mlTRAIL+1.0μg/ml顺铂作用后,都出现了明显的凋亡峰，亚G1期细胞百分率分别为29.3%，57%，83%。联合用药组明显高于单一用药组(P

2.2在荧光显微镜下，活细胞核呈弥散均匀荧光，出现凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密颗粒块状荧光。如图1示。

比较两图中的同一细胞高蓝/低红为凋亡细胞；低蓝/高红为坏死细胞；低蓝/低红为正常细胞。

2.3HOS-8603细胞经2.5ug/mlTRAIL+1.0ug/ml顺铂作用12h后,倒置显微镜下见细胞体积缩小，开始呈圆形，以细胞表面起泡，变成不规则形状。紧邻细胞之间出现空虚，有离群，脱落感。透射电镜下见凋亡细胞核内染色质的浓缩，形成染色质块，并集聚在核的边缘，呈半月形，花瓣状基底部紧贴核膜。胞质凝缩，最后核断裂，细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体，其外有完整的膜封闭，其内有结构完整的细胞器，还有凝缩的染色体；线粒体肿胀，空泡状，外膜破裂，内膜胀大呈气球状，脊消失。如图3所示。

图2A染色质浓缩，形成染色质块，并边聚在核的边缘，呈半月形，花瓣状，基底部紧贴核膜。

图2B线粒体肿胀，空泡化，内膜肿大呈气球状，脊消失。胞质间可见早期凋亡小体。

2.4经TRAIL+顺铂和TRAIL+顺铂+CsA处理后的细胞ΔΨm变化如表2所示;TRAIL+顺铂组的Rh123-PI-细胞百分率均明显高于空白对照组(P

2.5TRAIL+顺铂作用于HOS-8603细胞后Rh123-PI-与亚G1期细胞百分率间有直线相关关系(r=0.998,P

3讨论

联合化疗是目前提高骨肉瘤细胞对化疗的敏感性的研究热点。本研究中TRAIL+顺铂的MTT法测定抑制率为58.5%。明显优于两者单用(P

亚G1期细胞出现是细胞凋亡的标志之一。本研究中我们采用了TRAIL、顺铂,TRAIL+顺铂分别作用于HOS-8603细胞后测定亚G1期细胞百分率,结果显示TRAIL+顺铂组诱导细胞凋亡的作用显著高于TRAIL组和顺铂组(P

近年来研究证实，线粒体在细胞凋亡控制中起决定性作用［3,4］线粒体的早期改变为：线粒体膜通透性转运孔(MPTP)开放，释放线粒体内凋亡相关物质，这些物质激活Caspase-9酶系，从而引发连锁反应而诱导细胞凋亡。MPTP是跨膜多蛋白孔,可能由电压依赖的阴离子通道(VDAC)-腺苷酸移位酶-亲环蛋白-D(CyP-D)三联复合物构成［5-8］。在正常情况下MPTP只允许质子等分子量较小的物质通过线粒体膜,形成稳定ΔΨm。MPTP开放可导致ΔΨm下降或丧失,因此，可通过检测ΔΨm观察线粒体的改变［9-11］。本研究中我们发现经TRAIL和顺铂处理后的HOS-8603细胞ΔΨm随药物作用时间的增加而下降，并且与线粒体超微结构改变相一致。

顺铂和TRAIL联合化疗既增强骨肉瘤细胞对其化疗的敏感性，又减少了顺铂的使用剂量。我们相信TRAIL和顺铂的联合化疗方案会有很广阔的临床应用前景。由于体外细胞株培养不能模仿体内三维结构，不能准确反映药物-人体-肿瘤的复杂关系，且肿瘤具有一定的异质性。因此只能从实验的角度来肯定联合应用顺铂和TRAIL，能取得比单独应用顺铂或TRAIL更明显的对骨肉瘤细胞株的细胞毒性作用，为临床应用提供了实验依据，但进一步的结果尚需更深入的研究。

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