微生物菌种的筛选及鉴定

关于微生物菌种的筛选及鉴定本节要点食品工业上典型的微生物菌种微生物菌种的分离筛选及鉴定微生物菌种的发酵条件优化第2页,共70页，2024年2月25日，星期天一、典型工业微生物菌种细菌：枯草杆菌，短杆菌，大肠杆菌酵母：酿酒酵母（啤酒，葡萄酒），酒精酵母，假丝酵母霉菌：黑曲霉，土曲霉，米曲霉，红曲霉，根霉，木霉，青霉放线菌：单孢菌其他：藻类第3页,共70页，2024年2月25日，星期天发酵工业常见常用的细菌Leuconostocmesenteroides肠膜明串珠菌Pediococcuscerevisiae

啤酒足细菌Bacillussubtilis

枯草芽孢杆菌Acetobacteraceti

醋化醋杆菌Lactobacillusdelbrukii

德氏乳杆菌Steptococcuslactis

乳链球菌Clostridiumacetobutylcum丙酮丁醇梭菌

Corynebacterumpekinese

北京棒杆菌Brevibacteriumammoniagenes产氨短杆菌第4页,共70页，2024年2月25日，星期天常见工业微生物及其产物细菌短杆菌：谷氨酸、肌苷酸枯草芽孢杆菌：淀粉酶、蛋白酶、核糖大肠杆菌：酰胺酶节杆菌：强的松梭状杆菌：丙酮、丁醇第5页,共70页，2024年2月25日，星期天6工业上常用的放线菌及产物链霉菌属Streptomyces

生产抗生素、维生素、酶及酶抑制剂诺卡氏菌属Nocardia

生产抗生素，石油脱蜡、烃类发酵，处理含氰废水小单孢菌属Micromonospora

庆大霉素，Rifamycin孢囊链霉菌属Streptosporanium

多霉素放线菌第6页,共70页，2024年2月25日，星期天酵母酒精酵母：乙醇甘油酵母：甘油假丝酵母：环烷酸、SCP啤酒酵母：细胞色素、辅酶、酵母片类酵母：脂肪酶阿氏假囊酵母：核黄素脆壁酵母：乳糖酶常见工业微生物及其产物第7页,共70页，2024年2月25日，星期天霉菌黑曲霉：柠檬酸、蛋白酶、单宁酶、糖化酶栖土曲霉：蛋白酶根霉：糖化酶、甾体激素、青霉：青霉素、葡萄糖氧化酶木霉：纤维素酶红曲霉：糖化霉、红曲色素常见工业微生物及其产物霉菌分生孢子第8页,共70页，2024年2月25日，星期天SaccharomycescerevisiaeBEERBacillussubtilisB53NATTO第9页,共70页，2024年2月25日，星期天工业上对生产菌种的基本要求从自然界中分离目的菌种的原则菌种选育的一般方法二、食品工业微生物菌种的来源第10页,共70页，2024年2月25日，星期天112.1对工业微生物菌种的基本要求能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造可操作性要强遗传性能要相对稳定不易感染杂菌或噬菌体产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）生产特性要符合工艺要求第11页,共70页，2024年2月25日，星期天2.2从自然界中分离筛选菌种生产菌株来源

1、索取或购买2、自己选育用原有菌株进行遗传改造进行育种诱变育种/基因重组育种向菌种保藏机构索取、购买出发菌株进行选育从自然界中分离菌种

从自然界中分离菌种就是从自然界微生物资源中有目的、快速、准确地选出所需要的菌种。第12页,共70页，2024年2月25日，星期天

设计方案→采样→增殖培养*→平板分离→筛选（初筛、复筛）→单株纯种分离→性能考察（生产性能试验、毒性试验、菌种鉴定）从自然界中分离筛选菌种的一般步骤2.2.1采样

从自然界种采集含目的菌的样品第13页,共70页，2024年2月25日，星期天1. 环境条件对土样本中微生物分布的影响（1） 营养环境①高糖环境（加工蜜饯、糖果、蜂蜜的环境）土壤中：耐渗透压酵母，柠檬酸产生菌，氨基酸产生菌；②富含淀粉环境污泥、水沟旁土壤中：淀粉酶产生菌；③森林中腐叶烂草下土壤：纤维素酶产生菌；④含蛋白质（蚕丝、豆饼、生皮晒厂）土壤中：蛋白酶产生菌；⑤油田土：石油分解菌；第14页,共70页，2024年2月25日，星期天（2） 水分①取离地表5-15cm的土样②含水过多、过少都不理想（3） 温度：采样以秋季为好（4） 通风（5）酸碱度：细菌、放线菌：中性或偏碱；霉菌、酵母：偏酸第15页,共70页，2024年2月25日，星期天2.采样方法（1） 去除表层土（2） 取5-15cm土样几十克，装入无菌牛皮低袋或逆料袋中3. 注意记录：时间，地点，环境情况等样品袋应封好口，防止水分失去土样应在分离前破碎尽快分离第16页,共70页，2024年2月25日，星期天2.2.2增殖培养（富集培养）适用：样品中目的菌数量不够多时目的：提高样品中目的菌的数量和比例原理：通过控制营养成分或培养条件，使目的菌得以繁殖和/或非目的菌的生长受到抑制第17页,共70页，2024年2月25日，星期天1、方法（1） 控制营养成分

①

纤维素为唯一碳源，可增殖分解纤维素的菌②可溶性淀粉为唯一碳源，可增殖产淀粉酶的菌种③酒精废水，可以增殖废水利用菌*多种微生物所利用的碳源、氮源不能作控制因素（2） 控制培养基pH

细菌、放线菌：中性偏碱，真菌：偏酸

但非目的菌的生长不能被完全抑制第18页,共70页，2024年2月25日，星期天（3）控制培养温度30℃左右培养，可培殖嗜温微生物50~60℃培养，可培殖嗜热微生物，筛选耐热菌株（4）热处理——增殖芽孢细菌样品悬浮液经80℃、10min处理，杀死营养体，再添加营养培养后可增殖产芽孢细菌第19页,共70页，2024年2月25日，星期天（5）添加抑制剂10%苯酚数滴：抑制细菌、霉菌生长，增殖放线菌多粘菌素B：抑制G-细菌青霉素：抑制G+细菌制霉菌素：抑制真菌放线菌酮：抑制真菌第20页,共70页，2024年2月25日，星期天21实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选↓采样（造纸厂）→80℃30min处理文献:产生菌为中性芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5培养3～4d，选择有凹陷圈的菌落从285个土样中获得62株26株为组成型36株为诱导型第21页,共70页，2024年2月25日，星期天2.2.3纯种分离目的：将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获得纯培养1 纯种分离的一般方法稀释平板法倾注平板或涂布平板划线法第22页,共70页，2024年2月25日，星期天稀释分离涂布平板第23页,共70页，2024年2月25日，星期天稀释分离倾注平板第24页,共70页，2024年2月25日，星期天划线分离第25页,共70页，2024年2月25日，星期天（3）组织培养法适用于分离高等真菌及植物病原菌高等真菌：如香菇→切1小块菌盖→10%漂白粉消毒处理→无菌水冲洗→置琼脂平板上→培养→长出菌丝体注意：对蔓延性霉菌：①

加1%去氧胆酸钠②

察氏培养基：0.01%蔗糖，0.1%山梨糖第26页,共70页，2024年2月25日，星期天2、平皿反应快速检出法——定性或半定量（1）纸片培养显色法滤纸饱浸含有指示剂的液体培养基用接种环接种保湿恒温培养据菌落周围变色圈和菌落直径比值判别目的物产量（2）透明圈法

根据琼脂培养上透明圈/菌落直径大小判别目的产物的产量淀粉平板透明圈：淀粉酶碳酸钙平板透明圈：产酸酪素（蛋白）透明圈：蛋白酶第27页,共70页，2024年2月25日，星期天

以大肠杆菌E.coliATCC80739为指示菌，对枯草芽孢杆菌R21-4进行紫外诱变，筛选得到一株具有良好遗传稳定性的枯草芽孢杆菌R21-15，抗菌蛋白的效价提高58.49%。第28页,共70页，2024年2月25日，星期天粗提蛋白对棉花黄、枯萎病菌的抑制作用

第29页,共70页，2024年2月25日，星期天（3）变色圈法淀粉平板喷稀碘液：透明圈，液化型淀粉酶支链淀粉平板喷稀碘液：蓝色圈：异淀粉酶无色圈：液化型淀粉酶葡聚糖平板加刚果红：葡聚糖酶木聚糖平板加刚果红：木聚糖酶第30页,共70页，2024年2月25日，星期天（4）生长圈法工具菌：营养缺陷型，不能合成的物质（生长因素）为目的菌积累的产物菌落形态明显不同于目的菌方法：106~107工具菌与样品稀释液一起涂布至琼脂培养基表面，具有生长圈的菌落即为目的菌适用：氨基酸，核苷酸，维生素产生菌的选育第31页,共70页，2024年2月25日，星期天（5）抑制圈适用：抗生素产生菌的选育工具菌：对目的抗生素敏感的微生物例：目的菌为产生抗G+细菌的抗生素的菌株工具菌可使用金黄色葡萄球菌方法目的菌分离：稀释分离法，培养长出菌落代谢物积累：用打孔器（6MM）将菌落连同周围琼脂培养基一起取下，放一无菌空培养皿内，保湿培养4-5d，使新产生抗生素积累于小琼脂块中测定：取107工具菌涂布于琼脂培养基，将小琼脂块放于上面培养过夜，抑菌圈的出现，说明琼脂块中有抗生素，大小说明抗生素单位的高低第32页,共70页，2024年2月25日，星期天琼脂块培养法筛选抗生素产生菌程序第33页,共70页，2024年2月25日，星期天（6）菌落特征

从形态的角度菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。第34页,共70页，2024年2月25日，星期天35（7）从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素产物分子的结构定性分析（利用紫外扫描光谱、核磁共振、CD谱、高压液相色谱、远红外分析、X-射线衍射分析、穆斯堡尔谱等）产物的定量分析第35页,共70页，2024年2月25日，星期天3、厌氧性微生物的分离法（1）去除培养基中的溶解氧，降低Eh（氧化还原电位）煮沸法：将培养基置沸水中煮沸15分钟，驱除其中的溶解氧，勿再摇动，Eh可降至0.1V以下培养基预还原：将培养基中加入还原性物质：半胱氨酸，巯基化生物，Na2S，抗坏血酸等降低Eh第36页,共70页，2024年2月25日，星期天（2）创造无氧环境物理除氧空气置换法：干燥器或厌氧培养罐抽真空76mmHg→充入N2（反复3次）→充入CO210%+H210%+N280%化学除氧

H2+O2→H2O(钯作催化剂）GASPAK罐除氧：硼氢化钠、柠檬酸，碳酸氢钠化学反应产生H2

和CO2，H2与O2反应生成水厌氧指示剂第37页,共70页，2024年2月25日，星期天（3）厌氧分离（培养）技术高层琼脂柱技术厌氧罐技术厌氧手套箱技术厌氧手套箱第38页,共70页，2024年2月25日，星期天厌氧培养装置第39页,共70页，2024年2月25日，星期天第40页,共70页，2024年2月25日，星期天2.2.4筛选1、初筛：通风发酵菌种，通过摇瓶发酵进行，每株一瓶目的：淘汰80%-90%的分离菌株中的低产菌（1）培养条件：主要通过查阅资料及需要而预先决定：如培养基组成，通风量（装液量，摇瓶机转数），pH、温度、培养时间等。（2）分析测定：最好定量，如较困难时可采取半定量方法第41页,共70页，2024年2月25日，星期天2、复筛：每株3~5瓶，可提前培养种子，使接种量比较一致，3~5%接种量，培养条件可同初筛分析测定：定量，注意副产物复筛可进行多次，逐步淘汰，留下3~5株甚至最好的1株第42页,共70页，2024年2月25日，星期天初筛和复筛的比较第43页,共70页，2024年2月25日，星期天好氧培养第44页,共70页，2024年2月25日，星期天452.2.5复筛高产菌株的分类鉴定菌体形态特征分析菌体大小、排列、运动性、产芽孢（孢子）特征、产荚膜？鞭毛、菌丝分枝？染色特征生理生化特征分析碳源、氮源、无机盐、生长因子、产酶反应、药物敏感性遗传特征鉴定1、G+C（mol%)（差异>5%可以认为不同种，>10%可以认为不同属,2、16srRNA的基因序列（同源性>97%认为同种）第45页,共70页，2024年2月25日，星期天46举例：产PGA芽孢杆菌的鉴定细胞形态特征

菌体大小芽孢形状芽孢着生位置G+或G-等第46页,共70页，2024年2月25日，星期天47生理生化特征第47页,共70页，2024年2月25日，星期天第48页,共70页，2024年2月25日，星期天第49页,共70页，2024年2月25日，星期天502.2.6培养工艺条件试验与生产试验1、摇瓶发酵条件

培养基组成，初始pH，通风量（装液量），接种量，培养温度…2、小型台式发酵罐发酵工艺条件

溶解氧控制，pH值控制，原料添加模式，消泡剂…第50页,共70页，2024年2月25日，星期天51培养基配方的获得单因素试验多因素试验（正交试验）回归试验最佳配方的验证整个发酵条件的优化第51页,共70页，2024年2月25日，星期天举例

碳氮源对Bacillus

subtilis发酵产PGA的影响

基本发酵培养基：L-Glu20g/L，CTA10g/L，NH4Cl4g/L，MgSO4•7H2O0.5g/L，FeCl3•6H2O0.02g/L，K2HPO41g/L，CaCl2•2H2O0.2g/L，MnSO4•H2O0.05g/L,蒸馏水配制，用NaOH调pH7.4，0.1MPa灭菌20min。基本发酵条件:采用300mL三角瓶，装液量50mL，无菌培养容器封口膜封口，摇瓶转速150rpm，种子液种龄24h，接种量4%，37℃振荡培养96h。第52页,共70页，2024年2月25日，星期天初步确定可能的培养基成分(以碳源为例)第53页,共70页，2024年2月25日，星期天第54页,共70页，2024年2月25日，星期天第55页,共70页，2024年2月25日，星期天第56页,共70页，2024年2月25日，星期天第57页,共70页，2024年2月25日，星期天第58页,共70页，2024年2月25日，星期天枯草芽孢杆菌合成γ-PGA培养基优化的回归试验设计

对甘油及柠檬酸添加量的优化(正交组合设计)选择因素:Z1——甘油（g/L）,40～120;Z2——柠檬酸（g/L）,4～20

其它发酵条件为：Glu20g/L，(NH4)2SO47g/L，K2HPO4••••3H2O0.7g/L，MgSO4••7H2O0.5g/L，FeCl3•6H2O0.02g/L，CaCl20.25g/L，MnSO4•H2O0.3g/L，pH6.5，装液量50mL/300mL三角瓶，接种量4%(培养24h种子液)，摇瓶转速150r/min。取三水平，Z1：40，80，120;Z2：4，12，20。作变换：X1=（Z1-80）/40，X2=（Z2-12）/8试验方案及试验结果的分析下表

第59页,共70页，2024年2月25日，星期天第60页,共70页，2024年2月25日，星期天第61页,共70页，2024年2月25日，星期天第62页,共70页，2024年2月25日，星期天综合对碳源、氮源及无机离子的优化试验，得到优化发酵培养基（二）：L-Glu20g/L，CTA9.864g/L，Glycerol80.36g/L，(NH4)2SO47g/L，MgSO4•7H2O0.5g/L，FeCl3•6H2O0.0224g/L，K2HPO40.8922g/L，CaCl20.0323g/L，MnSO4•H2O0.3g/L,蒸馏水配置，用NaOH调pH6.5，0.1MPa灭菌20min。基本发酵条件：采用300mL三角瓶装液量50mL，种子液24h，接种量4%（v/v）,摇瓶转速150r/min，37℃振荡培养96h。第63页,共70页，2024年2月25日，星期天第64页,共70页，2024年2月25日，星期天摇瓶水平到反应器水平