口蹄疫灭活疫苗有效成分及稳定性问题解析

笔者在技术服务过程中，经常会遇到客户问一些如“发病后能否打口蹄疫疫苗？”“母猪、仔猪免疫后抗体水平怎么样、首免时间如何确定？”“疫苗是否是最新生产日期，有效期是多少？”“抗体水平如何？”等问题，更多的客户则关注如何选择口蹄疫疫苗？比如疫苗的有效抗原含量是多少？抗原衰减度如何？杂蛋白占比怎样？而疫苗中杂蛋白、内毒素、有效抗原含量都是衡量一个疫苗企业的工艺实力、保障优质疫苗的前提条件。

疫苗生产是系统工程，影响疫苗免疫效果的因素很多，就疫苗质量而言，一个真正合格的疫苗必须具备四大特性：安全、高效、均一、稳定。能否达到这些要求与疫苗生产工艺、保存、疫苗稳定性、检测评估方法、猪群状态等因素密切相关。1.口蹄疫抗原分析

在口蹄疫灭活疫苗中完整口蹄疫病毒粒子（146S粒子）是重要的免疫抗原，它的含量、完整性、稳定性决定了疫苗的免疫效果。口蹄疫病毒是无囊膜病毒，对氯仿不敏感，对温度、酸碱度等物理、化学物质比较敏感，如果保存不当、pH变化或温度升高的状态下，完整病毒146S容易分解为五聚体即12S（如下图1、2所示）。完整的口蹄疫病毒粒子一旦裂解，疫苗的免疫效果将大幅度降低，因此工艺控制及保护完整病毒粒子不降解是各个生产企业的绝密技术，如口蹄疫纯化、浓缩、保存技术都是口蹄疫生产中很难突破的技术，生产中如何保护146S抗原完整性又要保证疫苗纯度，去除非必需杂蛋白，两者关系是工艺攻关难点，完整病毒粒子配合优质佐剂，刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞，进而保护易感动物不被口蹄疫病毒感染，最终使口蹄疫灭活疫苗起到防控作用。

Figure1.DissociationofFMDVcapsidsintopentamericassembliesanddesignofthemodelsusedforMDsimulations.图1.口蹄疫衣壳蛋白在存储、加热、低pH条件下，完整病毒粒子146S裂解成12S五聚体（电镜图）引自：Publishedinfinaleditedformas:NatStructMolBiol.2015October;22(10):788–794.doi:10.1038/nsmb.3096.

Figure2.FMDV,serotypeO:(a)alone,(b)comparedwithIgMantibody

图2.O型口蹄疫完整病毒粒子能刺激机体产生早期IgM抗体

引自：F.Brown，Antibodyrecognitionandneutralizationoffoot-and-mouthdiseasevirus，1995AcademicPressLtd2.什么是146S?评价标准是什么？

146S是指口蹄疫病毒在繁殖子代病毒过程中，由病毒衣壳和基因组共同组成的完整粒子，不是所有的抗原都能产生有效抗体，能刺激机体产生有效抗体的抗原才称为有效抗原。口蹄疫完整病毒粒子在蔗糖密度梯度中的沉降系数为146S，所以我们就用146S来代表口蹄疫疫苗的有效抗原。

目前146S评价方法有蔗糖密度梯度离心法、紫外分光光度计定量法、液相色谱仪定量法、ELISA检测法等四种检测方法，但蔗糖密度梯度离心法是OIE推荐的金标准检测方法，大部分疫苗生产企业用此方法进行定量添加抗原，因为完整的146S抗原上有口蹄疫病毒的所有中和位点，能有效刺激动物机体产生抗体，因此完整的146S粒子的浓度多少，可作为一项评价口蹄疫疫苗质量的标准。3.口蹄疫疫苗抗原稳定性与免疫原性的关系

稳定的抗原和安全、有效的佐剂是疫苗研究的重点和难点。口蹄疫灭活疫苗的最大缺陷在于其稳定性很差，在低温长期储存、加热和微酸性环境中，病毒颗粒极其容易裂解，裂解产物也被称为12S，12S是一个由VP1、VP2、VP3组成的五聚体。因为五聚体之间存在大量的组氨酸残基，在酸性环境下组氨酸会迅速发生质子化，释放正电荷，通过静电排斥作用引发粒子裂解，这是口蹄疫不稳定的原因。由于146S粒子在酸性环境下分解成12S粒子，而12S表面的免疫反应位点被隐藏或发生形变的缘故，使12S不具备任何免疫原性，无法激发产生抗体，降低口蹄疫疫苗的免疫效力。口蹄疫病毒会在高温状态下，使组合状态的12S粒子转化为分解状态，因此口蹄疫病毒不宜长期暴露在高温状态下。口蹄疫疫苗效力与口蹄疫灭活疫苗中的146S粒子数量有关，若是能够确保146S粒子稳定不被分解，那么口蹄疫疫苗的效力就能到有效的保护，这也是口蹄疫灭活疫苗必须在2~8℃保存的原因。口蹄疫抗原稳定性差给口蹄疫疫苗的生产、储存和应用带来了很多困难，使用过程中必须全程冷链运输以保护口蹄疫的免疫原性。

从图3数据可知，金宇口蹄疫A型、O型灭活疫苗在2~8℃分别放置12个月，每月采用蔗糖密度梯度离心定量法检测146S含量，结果发现，146S抗原含量基本没有变化,说明疫苗有效抗原保存比较好，完整病毒粒子保存完整，对疫苗效力有极大的帮助。图3.口蹄疫灭活疫苗2~8℃放置12个月的含量的变化

Figure

3.changesinthecontentoftwoantigensafter12monthsat2-8℃图4.口蹄疫O型、A型疫苗反复多次冻融后抗原含量的变化Figure4.Changesinantigencontentoffoot-and-mouthdiseaseOandAvaccinesafterrepeatedfreezingandthawing

从图4数据可知，将口蹄疫灭活疫苗多次冷冻融化后，抗原含量降解比较多，每次反复冻融抗原损失20%~30%左右，5次反复冻融后，抗原损失70%左右，因此在保管疫苗时尽量不要冻融，冻融后的疫苗坚决不能使用，因为完整病毒粒子146S已经裂解为无效的12S五聚体。

表5.不同口蹄疫毒株在50℃条件下热稳定性试验Figure5.Thermalstabilitytestofdifferentfoot-and-mouthdiseasestrainsat50℃

从图5数据可知，口蹄疫不同毒株对热稳定性不一样，不同毒株组氨酸比列不一样，比列多可能更容易裂解，降解更快，免疫原性比较弱；如果温度高破坏了疫苗内部环境，使蛋白变性、酸度增加，完整病毒粒子146S已经裂解为无效的12S五聚体。从不同毒株特性分析，MYA98降解速率＞Asia-1＞OR/80＞OZK/93，说明MYA98毒株免疫活性优于其他毒株。口蹄疫OR/80、OZK/93在50℃条件下裂解8min后检测不到有效抗原，说明抗原稳定性最差。通过以上数据，期望对口蹄疫疫苗的稳定性研究奠定一定的理论基础。4.口蹄疫疫苗抗原保护剂、储存、运输口蹄疫病毒抗原对酸和热极其敏感，为了保证疫