课时基因工程的基本工具和基本操作程序

第十单元现代生物科技专题

第41课时基因工程的基本工具和基本操作程序高频考点突破考点一基因工程的概念理解和理论基础1.基因工程的概念理解(1)操作环境：体外——关键步骤“表达载体的构建”的环境。1整理课件(2)优点①与杂交育种相比：克服远缘杂交不亲和障碍。②与诱变育种相比：定向改造生物性状。(3)操作水平：分子水平。(4)原理:基因重组。(5)本质:甲(供体提供目的基因)乙(受体表达目的基因),即基因未变、合成蛋白质未变,只是合成场所的转移。2整理课件2.基因工程的基本原理和理论基础概括如下图

提醒

若题目强调“目的基因”的表达过程,则只包括“转录和翻译”两个过程,不包括目的基因的复制。3整理课件对位训练1.目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性,只有通过鉴定与检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是 ()①检测受体细胞中是否有目的基因②检测受体细胞中是否有致病基因③检测目的基因是否转

录出了mRNA④检测目的基因是否翻译成蛋白质A.①②③ B.②③④C.①③④ D.①②④C4整理课件2.科学家通过基因工程的方法，能使大肠杆菌产生人的胰岛素。以下叙述错误的是 （）A.可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒B.导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达C.DNA连接酶和限制性核酸内切酶都是构建重组质粒必需的工具酶D.目的基因的检测与鉴定表达过程中没有发生碱基互补配对D5整理课件考点二基因工程的操作工具1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”(1)来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。(2)化学本质：蛋白质。

(3)作用(4)作用特点：特异性,即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点。(5)切割方式催化作用,所以可重复利用可用于DNA的切割获取目的基因和载体的切割错位切：产生两个相同的黏性末端平切：形成平末端6整理课件

提醒

①切割的化学键为磷酸二酯键。②在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶,目的是产生相同的黏性末端。③将一个基因从DNA分子上切割下来,需要2个限制酶,同时产生4个黏性末端。④不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同,同一个DNA分子用不同的限制酶产生的黏性末端不相同。7整理课件2.DNA连接酶——“分子缝合针”常用类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体功能连接黏性末端连接黏性末端或平末端结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键8整理课件

拓展提升

DNA连接酶与DNA聚合酶的比较DNA连接酶DNA聚合酶作用实质都是催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键是否需模板不需要需要连接DNA链双链单链作用过程在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3′端的羟基上,形成磷酸二酯键作用结果将两个DNA片段连接成重组DNA分子合成新的DNA分子9整理课件3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”(1)类型

提醒

①质粒本质是DNA,不是细胞器;②特点:小型环状。(2)功能：将目的基因导入受体细胞。(3)应具备条件①能在宿主细胞内稳定保存并大量复制；②有一个至多个限制酶的切割位点,以便于与外源基因连接；

③有特殊的遗传标记基因,供重组DNA的检测和鉴定。最常用载体:质粒其他载体:λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等10整理课件

提醒

①一般来说,天然载体往往不能满足人类的所有要求,因此人们根据不同的目的和需要,对某些天然的载体进行人工改造。②常见的标记基因有抗生素基因、产生特定颜色的表达产物基因、发光基因等。③作为载体必须具有多个限制酶切点,而且每种酶的切点最好只有一个。因为某种限制酶只能识别单一切点,若载体上有一个以上的酶切点,则切割重组后可能丢失某些片段,若丢失的片段含复制起点区,则进入受体细胞后便不能自主复制。一个载11整理课件体若只有某种限制酶的一个切点,则酶切后既能把环打开接纳外源DNA片段,又不会丢失自己的片段。④注意与细胞膜上载体的区别,两者的化学本质和作用都不相同。⑤质粒能自我复制,既可在自身细胞、受体细胞也可在体外复制。12整理课件对位训练3.下列关于DNA连接酶作用的叙述，正确的是（）A.将单个核苷酸加到某DNA片段末端，形成磷酸二酯键B.将断开的两个DNA片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键C.连接两条DNA链上碱基之间的氢键D.只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，而不能将双链DNA片段平末端之间进行连接B13整理课件考点三基因工程的基本操作程序1.基因工程图解:抗虫棉的培育过程14整理课件2.基本操作程序(1)目的基因的获取①从基因文库(基因组文库或cDNA文库)中获取文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子无有基因中内含子无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种之间的基因交流可以部分基因可以说明基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤。从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便,缺点是工作量大,具有一定的盲目性15整理课件②人工合成目的基因:常用的方法有化学合成法和反转录法。化学合成法:蛋白质氨基酸序列RNA碱基序列DNA碱基序列用4种脱氧核苷酸人工合成目的基因反转录法:分离出供体细胞mRNA单链DNA合成目的基因

分析推测推测逆转录酶DNA聚合酶16整理课件③PCR扩增技术与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理DNA复制(碱基互补配对)原料四种游离的脱氧核苷酸条件模板、ATP、酶、原料、引物不同点解旋方式DNA在高温下变性解旋解旋酶催化场所体外复制(PCR扩增仪)主要在细胞核内酶热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)细胞内含有的DNA聚合酶结果在短时间内形成大量的DNA片段形成整个DNA分子17整理课件(2)基因表达载体的构建——最核心步骤①基因表达载体的组成:启动子、目的基因、终止子以及标记基因等。18整理课件

提醒

①与载体相比较,增加启动子、目的基因和终止子三个基因片段,其功能各不相同。②启动子(DNA片段)≠起始密码子(RNA);终止子(DNA片段)≠终止密码子(RNA)。

②基因表达载体的构建方法

提醒

该过程把三种工具(只有两种工具酶)全用上了,是最核心、最关键的一步,在体外进行。19整理课件

(3)将目的基因导入受体细胞细胞类型常用方法受体细胞转化过程植物细胞农杆菌转化法体细胞将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上动物细胞显微注射技术受精卵将含有目的基因的表达载体提纯→取卵→获得受精卵→显微注射→早期胚胎培养→胚胎移植→发育成为具有新性状的动物微生物细胞Ca2+处理增大细胞壁通透性原核细胞或酵母菌用Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收20整理课件

提醒

①唯一不涉及到碱基互补配对的操作步骤。②微生物做受体细胞主要是个体微小,代谢旺盛,繁殖速度快,获得目的基因产物多。③植物细胞还可用基因枪法和花粉管通道法。(4)目的基因的检测和表达21整理课件对位训练4.下列有关基因工程技术的叙述,正确的是（）A.重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和载体B.所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列C.选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快D.只要目的基因进入受体细胞就能实现表达C22整理课件5.利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列选项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是 （）A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNAC．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列D．酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白D23整理课件解题思路探究思维误区警示易错分析

基因工程中易错点辨析不清

(1)基因工程中有3种工具,但工具酶只有2种。

(2)工具酶本质为蛋白质,载体本质为小型DNA分子,但不一定是环状。(3)标记基因的作用——筛选、检测目的基因是否导入受体细胞,常见的有抗生素抗性基因、发光基因,表达产物为带颜色物质等。24整理课件(4)受体细胞中常用植物受精卵或体细胞(经组织培养)、动物受精卵(一般不用体细胞)、微生物——大肠杆菌、酵母菌等,但要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必需用真核生物酵母菌——需内质网、高尔基体的加工、分泌。一般不用支原体,原因是它营寄生生活;一定不能用哺乳动物成熟红细胞,原因是它无细胞核,不能合成蛋白质。25整理课件纠正训练1.(2009·浙江卷,3)下列关于基因工程的叙述,错误的是 ()A.目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B.限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C.人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D.载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达26整理课件

解析

基因工程中目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物;常用的工具酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶;人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性,只有经过一定的物质激活以后,才有生物活性。载体上的抗性基因主要是有利于筛选含重组DNA的细胞,不能促进目的基因的表达。所以D错误。答案

D27整理课件2.(2009·重庆卷,2)下表有关基因表达的选项中,不可能的是 ()基因表达的的细胞表达产物A细菌抗虫蛋白基因抗虫棉叶肉细胞细菌抗虫蛋白B人酪氨酸酶基因正常人皮肤细胞人酪氨酸酶C动物胰岛素基因大肠杆菌工程菌细胞动物胰岛素D兔血红蛋白基因兔成熟红细胞兔血红蛋白28整理课件

解析

细菌抗虫蛋白基因可通过转基因技术转入棉花体内,在棉花的叶肉细胞中表达产生细菌抗虫蛋白,使棉花具有抗虫能力;人酪氨酸酶基因可在正常人的皮肤细胞中表达产生酪氨酸酶,酪氨酸酶催化酪氨酸转化为黑色素;动物胰岛素基因可通过转基因技术转移到大肠杆菌体内,在大肠杆菌工程菌细胞中合成动物胰岛素;兔属于哺乳动物,其成熟的红细胞中没有细胞核,所以不可能表达出血红蛋白。

答案

D29整理课件3.(2009·安徽卷,4)2008年诺贝尔化学奖授予了“发现和发展了水母绿色荧光蛋白”的三位科学家。如果将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因,再将该融合基因转入真核生物细胞内,表达出的蛋白质就会带有绿色荧光。绿色荧光蛋白在该研究中的主要作用是()A.追踪目的基因在细胞内的复制过程B.追踪目的基因插入到染色体上的位置C.追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布D.追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构30整理课件

解析

将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因,将该融合基因转入真核生物细胞内,表达出的蛋白质带有绿色荧光,从而可以追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布。故C正确。

答案

C31整理课件知识综合应用重点提示

通过“抗虫作物培育过程的有关基因工程知识”的考查,提升“综合运用所学知识解决自然界和社会生活中有关生物学问题”的能力。典例分析(2009·江苏卷,34)苏云金杆菌(Bt)能产生具有杀虫能力的毒素蛋白。下图是转Bt毒素蛋白基因植物的培育过程示意图(ampr为抗氨苄青霉素基因),据图回答下列问题。32整理课件33整理课件(1)将图中①的DNA用HindⅢ、BamHⅠ完全酶切后,反应管中有

种DNA片段。(2)图中②表示HindⅢ与BamHⅠ酶切、DNA连接酶连接的过程,此过程可获得

种重组质粒;如果换用BstⅠ与BamHⅠ酶切,目的基因与质粒连接后可获得

种重组质粒。(3)目的基因插入质粒后,不能影响质粒的

。(4)图中③的Ti质粒调控合成的vir蛋白,可以协助带有目的基因的T-DNA导入植物细胞,并防止植物细胞中

对T-DNA的降解。34整理课件(5)已知转基因植物中毒素蛋白只结合某些昆虫肠上皮细胞表面的特异受体,使细胞膜穿孔,肠细胞裂解,昆虫死亡。而该毒素蛋白对人类的风险相对较小,原因是人类肠上皮细胞

。(6)生产上常将上述转基因作物与非转基因作物混合播种,其目的是降低害虫种群中的

基因频率的增长速率。35整理课件

解析

本题重点考查转基因技术的相关知识,需特别注意基因工程的步骤、DNA的复制、基因工程的操作工具等知识。本题需特别注意图示过程,从中获取有效信息,然后结合课本知识即可正确解答。

答案

(1)4(2)21(3)复制(4)DNA水解酶(5)表面无相应的特异性受体(6)抗性36整理课件定时检测组题说明特别推荐

综合应用题——1、3；知识拓展提升题——2、6、8。考点题号基因工程的工具1～8基因工程的步骤37整理课件1.(2009·福建理综,32)转基因抗病香蕉的培育过程

如图所示。质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ

等四种限制酶切割位点。请回答:(1)构建含抗病基因的表达载体A时,应选用限制酶

,对

进行切割。(2)培养基中的卡那霉素会抑制香蕉愈伤组织细胞的生长,欲利用该培养基筛选已导入抗病基因的香蕉细胞,应使基因表达载体A中含有

,作为标记基因。38整理课件(3)香蕉组织细胞具有

,因此,可以利用组织培养技术将导入抗病基因的香蕉组织细胞培育成植株。图中①、②依次表示组织培养过程中香蕉组织细胞的

。

解析

本题考查基因工程的有关知识。(1)从图可看出,只有PstⅠ、EcoRⅠ两种酶能保持抗病基因结构的完整性,所以构建含抗病基因的表达载体A时,应选用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ两种酶,对抗病基因的DNA和质粒进行切割。(2)卡那霉素能抑制香蕉愈伤组织细胞的生长,欲利用该培养基筛选已导入抗病基因的香蕉细胞,应39整理课件

使基因表达载体A中含有抗卡那霉素基因,以此作为标记基因。(3)香蕉组织细胞具有全能性,因此,可以利用组织培养技术将导入抗病基因的香蕉组织细胞培育成植株。图中①、②依次表示组织培养过程中香蕉组织细胞的脱分化和再分化。

答案

(1)PstⅠ、EcoRⅠ含抗病基因的DNA、质粒(2)抗卡那霉素基因(3)全能性脱分化、再分化40整理课件2.(2008·江苏卷,32)将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗,饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。41整理课件表1引物对序列表引物对AP1AACTGAAATGTAGCTATCP2TTAAGTCCATTACTCTAG引物对BS1GTCCGACTAGTGGCTGTGS2AGCTGGCGTTTAGCCTCG42整理课件请根据以上图表回答下列问题:(1)在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中,使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶,其最主要的特点是

。(2)PCR过程中退火(复性)温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列,图2为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？

。限制酶AluIEcoRIPstISmaI切割位点AG↓CTTC↑GAG↓AATTCCTTAA↑GCTGCA↓GG↑ACGTCCCC↓GGGGGG↑CCC43整理课件(3)图1步骤③所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端的碱基序列是否有专一性要求？

。(4)为将外源基因转入马铃薯，图1步骤⑥转基因所用的细菌B通常为

。(5)对符合设计要求的重组质粒T进行酶切。假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图1中标示的酶切位点和表2所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。

①采用EcoR

I和PstI酶切,得到

种DNA片断。②采用EcoR

I和SmaI酶切,得到

种DNA片断。44整理课件

解析

(1)PCR技术中需通过高温使DNA解旋,故所用DNA聚合酶的耐热性必须要好。(2)退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基因序列的长度。含有(G+C)多的引物,可采用相对较高的退火温度。(3)DNA聚合酶与限制酶不同,从将DNA由5’端点开始复制到3’端的酶,不具有特异性。(4)农杆菌的细胞中有一段T-DNA,农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后,可将T-DNA插入到植物基因中,因此,农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系,常用作植物转基因工程中的载体。45整理课件

(5)对于重组质粒,EcoRI能切开M和X连接处,PstI能在M和N之间专一切点处切开,将DNA分为两个片段;

EcoRI仍能切开M处,SmaI则不能识别N和Y重新结合形成的连接点,只能得到1个DNA片段。

答案

(1)耐高温(2)引物对B(3)否(4)农杆菌(5)①2②146整理课件3.基因工程中,需使用的限制酶切割目的基因和质粒,便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—,限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。47整理课件(1)根据已知条件和图回答：①上述质粒用限制酶

切割,目的基因用限制酶

切割。②将切下的目的基因片段插入质粒的切口处,还要加入适量的

。③请指出质粒上至少要有一个标记基因的理由：

。(2)不同生物的基因可以拼接的结构基础是

。(3)大肠杆菌是首先成功表达外源基因的宿主菌,但不能表达结构复杂的蛋白质,哺乳类细胞、昆虫48整理课件细胞表达系统虽然能表达结构复杂的哺乳类细胞蛋白,但操作复杂,表达水平低,不易推广使用。基因工程中常选用酵母菌作为受体细胞,请从细胞结构等方面分析用酵母菌作受体细胞能克服上述不足的理由：

。

答案

(1)①ⅠⅡ②DNA连接酶③检测重组质粒(或目的基因)是否导入受体细胞(2)DNA结构基本相同(其他合理答案均可)(3)①单细胞真核生物,含有加工、修饰蛋白质的内质网和高尔基体;

②繁殖速度快,能很快得到大量的目的基因;③培养成本低;④容易培养49整理课件4.在培育转基因植物的研究中,卡那霉素抗性基因(kanr)常作为标记基因,只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程。50整理课件请据图回答：(1)A过程需要的酶有

。(2)B过程及其结果体现了质粒作为载体必须具备的两个条件是

。(3)C过程的培养基除含有必要营养物质、琼脂和激素外,还必须加入

。(4)如果利用DNA分子杂交原理对再生植株进行检测,D过程应该用

作为探针。(5)科学家发现转基因植株的卡那霉素抗性基因的传递符合孟德尔遗传规律。51整理课件①将转基因植株与

杂交,其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为1∶1。②若该转基因植株自交,则其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为

。③若将该转基因植株的花药在卡那霉素培养基上作离体培养,则获得的再生植株群体中抗卡那霉素型植株占

%。

解析

重组质粒的获得需要限制酶和DNA连接酶;作为载体必须具备以下几个条件：一是能够在宿主细胞中复制并稳定保存;二是具有多个限制酶切52整理课件点,以便与外源基因连接;三是具有某些标记基因,便于进行筛选等。B过程体现出了其中的一、三两条。转基因植株与非转基因植株杂交后,后代表现型比例为1∶1,说明转基因植株为杂合子,该杂交过程相当于测交;如果自交,则后代比例应为3∶1;卡那霉素对花粉进行了选择,保留下了抗卡那霉素的植株。

答案

(1)限制酶和DNA连接酶(2)具有标记基因;能在宿主细胞中复制并稳定保存(3)卡那霉素(4)放射性同位素(或荧光分子)标记的抗虫基因(5)①非转基因植株②3∶1③10053整理课件5.如图为利用生物技术获得生物新品种的过程,据图回答：(1)在基因工程中,A→B为

技术,利用的原理是

,其中①为

过程。

(2)加热至94℃的目的是使DNA中的

键断裂,这一过程在细胞内是通过

的作用来完成的。54整理课件(3)当温度降低时,引物与模板末端结合,在DNA聚合酶的作用下,引物沿模板链延伸,最终合成两条DNA分子,此过程中的原料是

,遵循的原则是

。(4)目的基因导入绵羊受体细胞常用

技术。(5)B→D为抗虫棉的培育过程,其中④过程常用的方法是

,要确定目的基因(抗虫基因)导入受体细胞后是否能稳定遗传并表达,需进行检测和鉴定工作,请写出在个体生物学水平上的鉴定过程：

。55整理课件

解析

(1)A→B为体外DNA复制即PCR技术,与体内DNA复制原理相同,解旋方式不同,PCR技术是用高温变性使其解旋。(2)94℃时DNA双链解旋,破坏的是两条链之间的氢键,而在细胞内DNA复制解旋时解旋酶起相同作用。(3)PCR技术与DNA复制过程原理是相同的,即碱基互补配对,原料均为4种脱氧核苷酸。(4)转基因动物培育中目的基因的导入常用显微注射技术。

(5)将目的基因导入植物细胞常用的方法为农杆菌56整理课件转化法,其优点是能将外源基因导入到受体细胞的染色体DNA分子上;在个体水平上鉴定,即通过生物体所体现的性状来判断,抗虫棉应具有的性状为害虫吞食后使其死亡。

答案

(1)PCRDNA复制DNA解旋(2)氢解旋酶(3)4种脱氧核苷酸碱基互补配对原则(4)显微注射(5)农杆菌转化法让害虫吞食转基因棉花的叶子,观察害虫的存活情况,以确定性状57整理课件6.下图a表示基因工程中经常选用的载体——pBR322质粒,Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,Tetr表示四环素抗性基因。目的基因如果插入某抗性基因中,将使该基因失活,而不再具有相应的抗性。为了检查载体是否导入原本没有Ampr和Tetr的大肠杆菌,将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素的培养基上。得到如图b的结果(黑点表示菌落)。再次灭菌的绒布按到图b的培养基上,使绒布面沾上菌落,然后将绒布平移按到含四环素的培养基上培养,得到如图c的结果(空圈表示与b对照无菌落的位置)。据此分析并回答：58整理课件(1)pBR322质粒的基本组成单位是

。该基因工程中,质粒上的Ampr、Tetr称为基因。(2)与图c空圈相对应的图b中的菌落表现型是

,由此说明目的基因插入了

中。(3)质粒作为基因表达载体除了具有Ampr或Tetr及目的基因外,还必须具有