多聚酶链式反应扩增片断

关于多聚酶链式反应扩增片断★分子生物学研究中最强大的实验技术之一★其本质是在体外模拟胞内DNA分子复制的过程美国科学家穆利斯(K.B.Mullis)发明了PCR技术1993年诺贝尔奖第2页,共52页，2024年2月25日，星期天㈠.DNA分子的结构C、H、O、N、P1.元素组成：脱氧核苷酸2.基本单位:一.基础知识脱氧核苷酸脱氧核苷磷酸脱氧核糖含氮碱基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）第3页,共52页，2024年2月25日，星期天一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第3位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二酯键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3’和5’碳原子之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’、5’、磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端3.多脱氧核苷酸链得形成多脱氧核苷酸链结构简图第4页,共52页，2024年2月25日，星期天4.DNA分子的双螺旋结构⑴.DNA分子是由

的（即一条链为3’－5’，另一条链为5’－3’）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则

结构。⑵.

与

交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；

排列在链的内侧。⑶.两条链上的碱基通过

连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与

配对，

一定同胞嘧啶配对。双螺旋两条反向平行脱氧核糖磷酸碱基氢键胸腺嘧啶鸟嘌呤第5页,共52页，2024年2月25日，星期天㈡.DNA的复制2.时期有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期。3.场所细胞核（主要）、线粒体、叶绿体。1.概念由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程。4.基本条件酶:解旋酶、DNA聚合酶能量:ATP原料:四种脱氧核苷酸模板:DNA的两条链第6页,共52页，2024年2月25日，星期天⑴.边解旋边复制(过程）5.复制特点⑵.半保留复制（结果）6.遵循原则：碱基互补配对原则7.精确复制的原因8.复制的意义DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性⑴规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板⑵碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行第7页,共52页，2024年2月25日，星期天总结：胞内DNA复制的基本体系打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸第8页,共52页，2024年2月25日，星期天(二）PCR原理及条件1．概念：PCR即_______________，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的_____为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。多聚酶链式反应DNA2．DNA的平面结构：AGCT5'端3'端氢键ATGC3'端:-OH端5'端:磷酸基团的末端注意：1、DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3‘端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物

2、DNA的合成方向总是从子链的5‘端向3‘端延伸第9页,共52页，2024年2月25日，星期天（1）、DNA

分子的热变性原理DNA双链单链变性（加热80-100℃）复性（缓慢冷却）变性的目的：复性的目的：解开双链有利于引物与两条单链结合在80~100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。3、PCR原理第10页,共52页，2024年2月25日，星期天①在80－100°C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性.②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链.

高温虽然打开了双链，可会导致酶失活。怎么办？

第11页,共52页，2024年2月25日，星期天耐高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化.3、TaqDNA聚合酶的应用第12页,共52页，2024年2月25日，星期天（3）、PCR反应的条件①DNA模板；②分别与两条模板链相结合的两种引物（引物Ⅰ和引物Ⅱ）；③四种脱氧核苷酸；④耐高温的聚合酶（TaqDNA聚合酶）；⑤控制温度，但不需解旋酶；⑥需要在一定的缓冲液中进行。第13页,共52页，2024年2月25日，星期天1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸高温变性低温复性重复1~3步30轮（2）、步骤：变性——复性——延伸第14页,共52页，2024年2月25日，星期天解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（RNA）打开DNA双链模板合成子链原料催化子链合成使DNA聚合酶能从引物3′端开始连接脱氧核苷酸

思考：3、体内DNA复制的条件是什么？体外扩增DNA如何提供相似环境？

变性（80-100℃

）Taq聚合酶（耐高温）20—30个核苷酸构成DNA或RNA第15页,共52页，2024年2月25日，星期天细胞内DNA的复制与PCR的比较第16页,共52页，2024年2月25日，星期天DNA聚合酶与DNA连接酶的异同第17页,共52页，2024年2月25日，星期天PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等特点。6

、PCR技术的特点第18页,共52页，2024年2月25日，星期天（五）PCR的反应过程1、PCR的反应步骤PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸①变性（模板DNA解旋）模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备2、循环过程第19页,共52页，2024年2月25日，星期天靶序列靶序列PCR循环第一步：加热变性第20页,共52页，2024年2月25日，星期天②复性（退火）

模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合第21页,共52页，2024年2月25日，星期天靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循环第二步：引物与靶序列退火第22页,共52页，2024年2月25日，星期天③延伸DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链第23页,共52页，2024年2月25日，星期天靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循环第三步：引物延伸第24页,共52页，2024年2月25日，星期天靶序列

靶序列第1个PCR循环完成后：得到两个拷贝的靶序列第25页,共52页，2024年2月25日，星期天第26页,共52页，2024年2月25日，星期天4、循环特点：①上一次循环的产物为下一循环的模板②结果单链中有最初母链的只两条（无引物存在于两个子代DNA分子中③其它子代DNA分子都为双引物分子式④处于两引物之间的DNA序列呈指数增长1×2N①②第27页,共52页，2024年2月25日，星期天4、PCR循环的结果②DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸第28页,共52页，2024年2月25日，星期天3、30次循环后靶序列扩增的数量第29页,共52页，2024年2月25日，星期天PCR反应条件：

①稳定的缓冲液环境②DNA模板③分别与两条模板链相结合的两种引物④A、T、G、C四种脱氧核苷酸

⑤耐热的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶

⑥能严格控制温度变化的温控设备第30页,共52页，2024年2月25日，星期天1、PCR仪㈠.设备及用具实质上一台能够自动调控温度的仪器。二.PCR的实验操作第31页,共52页，2024年2月25日，星期天2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。第32页,共52页，2024年2月25日，星期天微量离心管微量移液器第33页,共52页，2024年2月25日，星期天1、准备2、移液（二）实验操作步骤

按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂第34页,共52页，2024年2月25日，星期天①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁②注意：3、混合B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢第35页,共52页，2024年2月25日，星期天将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序①过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s4、离心5、反应②离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果第36页,共52页，2024年2月25日，星期天PCR三步曲

预变性保温变性94℃30s延伸72℃1min复性55℃30s94℃5min第37页,共52页，2024年2月25日，星期天第38页,共52页，2024年2月25日，星期天PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：6、注意事项①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；②分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头第39页,共52页，2024年2月25日，星期天（一）理论上DNA扩增数目的计算三、课题成果评价1、一条DNA，复制n次，DNA为2n2、a条DNA，复制n次，DNA为ax2n（二）实验中DNA含量的测定1、原理可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关第40页,共52页，2024年2月25日，星期天稀释2μLPCR反应液，加入98L蒸馏水，即将样品进行50倍稀释对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零测定取DNA稀释液100μL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值计算DNA含量（g/ml）＝50×(260nm的读数）×稀释倍数2.过程第41页,共52页，2024年2月25日，星期天第42页,共52页，2024年2月25日，星期天比色杯第43页,共52页，2024年2月25日，星期天PCR的突出优点快速高效灵活易于操作四、课题延伸例如：PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）第44页,共52页，2024年2月25日，星期天五、实验小结PCR仪加热使（）变性,复性使引物与模板DNA（）,延伸需将反应温度升至中温(),在（）的作用下,以（）为原料,以（）为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,经（）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。模板互补Taq聚合酶四种脱氧核苷酸引物变性、复性和延伸72℃第45页,共52页，2024年2月25日，星期天1.提示：绘图可参考教科书中图5-9。PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累，其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段（2n=230=1073741824)。2.提示：PCR引物是根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计的。引物的设计需要丰富的分子生物学实验经验，感兴趣的学生可以参考《分子克隆实验指南》（见本专题参考书目），书中有详尽的论述。书后题第46页,共52页，2024年2月25日，星期天㈠.理论上DNA扩增数目的计算三.课题成果评价1.一条DNA，复制n次，DNA为2n2.a条DNA，复制n次，DNA为a×2n㈡.实验中DNA含量的测定1.原理可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。2.过程⑴.稀释2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释.第47页,共52页，2024年2月25日