《DB32T 3762.17-2021新型冠状病毒检测技术规范 第17部分核酸检测用假病毒阳性质控品》

ICS13.100

C50

DB32

江苏省地方标准

DB32/T3762.17—2021

新型冠状病毒检测技术规范

第17部分：核酸检测用假病毒阳性质控品

TechnicalspecificationsforSARS-CoV-2detection

Part17:Pseudoviruspositivecontrolmaterialfornucleicaciddetection

2021-12-09发布2022-01-09实施

江苏省市场监督管理局发布

DB32/T3762.17—2021

新型冠状病毒检测技术规范第17部分：核酸检测用假病毒阳性质控品

1范围

本文件规定了新型冠状病毒核酸检测用假病毒类弱阳性质控品的术语和定义、缩略语、试剂和材料、

仪器和设备、假病毒原液的技术要求、质控品的制备和质控品的技术要求。

本文件适用于新型冠状病毒核酸检测用假病毒类弱阳性质控品的技术要求以及评价方法。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

JJF1006一级标准物质技术规范

JJF1343标准物质定值的通用原则及统计学原理

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

质控品controlmaterial

用于体外诊断的质量控制物质，是一种旨在用于医学用途的检测系统中使用的物质、材料、物品或

设备，其目的是评价或验证测量精密度、测量准确度、由于试剂或分析仪器的变化检测系统可能产生的

分析偏差等性能特征，可用于能力验证、实验室内质量控制。

3.2

假病毒pseudovirus

一种具有病毒拟似的物理结构和特异性核酸序列的病毒样粒子，其分析特性与真实病毒相似，但不

具备自我复制和感染的能力。

3.3

假病毒质控品pseudoviruscontrolmaterial

由假病毒原料定量分装后制成，能够参与到病毒检测从提取到扩增的全过程；具有生物安全性的同

时可作为测量标准，用于病毒核酸定性和定量测量方法的验证评价以及实验室的质量控制。

3.4

计量溯源性metrologicaltraceability

1

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通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测量结果或测量标准的值能够与规定的参考标准

（通常是与国家测量标准或国际测量标准）联系起来的特性。

3.5

同源性homology

两个核酸分子的核苷酸序列间的相似程度。本文指假病毒质控品中目的基因序列与相应的真实病毒

参考毒株序列的一致性。

3.6

均匀性uniformity

同一批次生产的假病毒质控品，每个最小包装单元含有等量的目标假病毒的状态。通过测量取自不

同包装单元或取自同一包装单元的、特定量的样品，定量测量结果落在规定不确定度范围内，则可认为

质控品所含目标假病毒的量是均匀的。

3.7

稳定性stability

假病毒质控品在特定的保存条件和保存时间内，假病毒的量保持在规定范围内的能力。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

DMEM：Dulbecco改良培养基（Dulbecco’smodifiedeagle’smedium）

PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）

qPCR：荧光定量聚合酶链式反应（quantitativepolymerasechainreaction）

RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction）

RT-qPCR：逆转录荧光定量聚合酶链式反应（reversetranscriptionquantitativepolymerasechain

reaction）

RNase：核糖核酸酶（ribonuclease）

5技术要求

5.1假病毒质控品的技术要求主要分为两个方面，包含对假病毒原液的技术要求，如假病毒内靶标

RNA序列的同源性、假病毒原液的杂质残留等；还包含对质控品成品的技术要求，如靶标RNA定值、

均匀性、稳定性等。

5.2假病毒质控品必须同时满足以下8点技术要求，才能作为新型冠状病毒核酸检测用的弱阳性质控

品：

a)用于制备质控品的原料假病毒含有与新冠核酸检测的靶标RNA序列一致的RNA；

b)用于制备质控品的假病毒原液不含有cDNA杂质；

c)用于制备质控品的假病毒原液无菌；

d)质控品的靶标RNA浓度为试剂盒检出限的1.5-3倍左右，且定值结果具有计量溯源性；

2

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e)质控品同批次均匀性合格；

f)质控品短期、长期及极端环境下稳定性合格；

g)质控品适用于至少8款获批上市的新型冠状病毒核酸检测试剂盒。

6试剂和材料

6.1无酶水：GB/T6682中的一级水，应为无RNA酶的水。

6.2PCR、RT-PCR、RT-qPCR、数字PCR相关试剂：商品化试剂。

6.3PCR引物、探针：参照权威机构公布的序列或自行设计。

6.4RNase：商品化试剂。

6.5无RNA酶的各型号枪头、EP管、PCR管、离心管、试管：商品化耗材。

6.6本文件中所有的化学试剂，除特别说明外，全部为分析纯级别试剂。

7仪器和设备

7.1生物安全柜。

7.2普通离心机、冷冻离心机。

7.3恒温水浴锅。

7.4PCR仪。

7.5核酸电泳仪。

7.6凝胶成像系统。

7.7荧光定量PCR仪。

7.8数字PCR系统。

7.9各型号移液器。

7.10培养箱。

8假病毒原液的技术要求

8.1靶标RNA序列同源性的检测

8.1.1检测方法

8.1.1.1RT-PCR检测

提取假病毒的RNA作为模板。选用中国疾病预防控制中心或世界卫生组织推荐的（见表1）或根

据靶标RNA自行设计的引物进行RT-PCR扩增。设置以水为模板的阴性对照，以含靶标RNA的标

准物质为模板的阳性对照。扩增产物经电泳分离、回收反应产物。

3

DB32/T3762.17—2021

表1中国疾病预防控制中心、世界卫生组织推荐的新型冠状病毒核酸检测引物和探针序列

目标基因引物/探针序列（5’—3’）

FCCCTGTGGGTTTTACACTTAA

ORF1abRACGATTGTGCATCAGCTGA

P5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'

FGGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT

NRCAGACATTTTGCTCTCAAGCTG

P5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'

FACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT

ERATATTGCAGCAGTACGCACACA

P5'-FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BBQ-3'

8.1.1.2测序及溯源性分析

将8.1.1.1的产物测序。测序结果与相应的新型冠状病毒核酸检测靶标RNA的参考序列进行比

对。

8.1.2结果判定

在RT-PCR阴性对照和阳性对照都成立的情况下：

a)若满足假病毒RNA的RT-PCR产物的电泳结果为阳性且测序结果比对一致，则为合格；

b)若假病毒RNART-PCR产物的电泳结果为阴性，则表明假病毒未包裹病毒RNA，或假病毒

核酸提取失败，应重新制备假病毒或提取核酸。

8.2cDNA杂质的检测

8.2.1检测方法

分别以未做核酸提取的假病毒原液和假病毒中提取的RNA为模板，使用推荐的或自行设计的引

物和探针或商品化试剂盒进行qPCR扩增。设置以水为模板的阴性对照，以重组质粒为模板的阳性对

照。

8.2.2结果判定

在阴性对照和阳性对照都成立的情况下：

a)若未提取的假病毒原液和/或假病毒提取的RNA的qPCR结果为阳性，即出现典型的S型

扩增曲线或依据试剂盒说明书判定，则表明原液中或假病毒内含有cDNA杂质，即为不合格，

应重新消化去除cDNA杂质。

b)若未提取的假病毒原液和假病毒提取的RNA的qPCR结果为阴性，即未起峰或依据试剂盒

说明书判定，说明无cDNA，即为合格。

8.3无菌检测

用DMEM培养基37℃培养假病毒原液24h，溶液澄清，无菌生长，即为合格。

9质控品的制备

4

DB32/T3762.17—2021

对结果判定为合格的假病毒原液，根据需要使用适当的溶剂对假病毒原料进行稀释后，分装至冻存

管，直接或冻干后-20℃保存。具体制备过程本文件不作赘述。

10质控品的技术要求

10.1新型冠状病毒靶标RNA的定量

10.1.1基本要求

采用核酸提取方法提取假病毒质控品的RNA，采用RT-qPCR法或数字PCR法对靶标RNA

的浓度进行定值。使用推荐的或自行设计的引物和探针或商品化试剂盒进行定值。核酸提取方法和靶标

RNA浓度的定值方法均应通过适宜的国家有证标准物质的验证方可采用。

10.1.2RT-qPCR定量法

10.1.2.1使用RT-qPCR法进行定量时，所使用的具体方法应为针对新型冠状病毒靶标RNA片段

设计建立的方法。

10.1.2.2标准品可以为拷贝数已知的新型冠状病毒RNA或cDNA，或含有相关目的DNA片段的

重组质粒。

10.1.2.3将标准品以10倍进行梯度稀释至少5个梯度，分别以每个梯度的标准品溶液作为模板，

进行RT-qPCR反应，根据各梯度标准品的Ct值和浓度制定标准曲线和公式。

10.1.2.4根据质控品RNA的Ct值，利用标准曲线和公式计算出质控品中新型冠状病毒靶标RNA

的浓度。

10.1.3数字PCR定量法

10.1.3.1使用数字PCR法进行定量时，所使用的具体方法应为针对新型冠状病毒靶标RNA片段设

计建立的方法。

10.1.3.2提取假病毒RNA，上样至数字PCR反应体系，进行数字PCR反应。按照式（1）计算质

控品RNA的浓度。

CA

C1（1）

B

C—质控品中靶标RNA的原始浓度，单位为拷贝每微升；

C1—数字PCR检测结果所示的靶标RNA的浓度，单位为拷贝每微升；

A—数字PCR反应体系中靶标RNA的稀释倍数；

B—核酸提取时靶标RNA的浓缩倍数。

10.1.4靶标RNA浓度的计算

定值结果采取10.1.2或10.1.3所述的方法进行靶标RNA的浓度计算，质控品浓度为新冠核酸

检测试剂盒检出限的1.5-3倍左右即为合格。

10.2均匀性检测

10.2.1检测方法

5

DB32/T3762.17—2021

按照JJF1006和JJF1343的要求，依据每一批次质控品的制备数量，随机抽样选择不同数量的包

装单元进行均匀性检测。对质控品进行核酸提取后，按10.1.2或10.1.3的方法进行靶标RNA浓度

测定，计算每一个包装单元靶标RNA的浓度。

10.2.2均匀性判定

对所得数据按照JJF1006和JJF1343的统计学要求进行检验，若结果无显著性差异，则质控品

均匀性良好，即为合格。若存在显著性差异，即为均匀性不合格。

10.3稳定性检测

10.3.1短期稳定性

短期稳定性评价质控品在使用温度（20±5）℃和运输温度4℃下的稳定性。按JJF1006和JJF1343

的方法进行评价。按10.1.2或10.1.3的方法进行靶标RNA浓度测定。

10.3.2长期稳定性

长期稳定性评价质控品在存储温度