从药学的观点评价血凝酶

关于从药学的观点评价血凝酶蛇毒类凝血酶（SVTLEs）（一）

蛇毒中除含有神经毒性多肽生物活性物质和蛋白质外，蛇毒尚含有多种影响凝血过程蛋白水解酶。这些蛋白水解酶参与体外凝血，存在于多种蛇毒中，本质属于丝氨酸蛋白酶是一种结构至少部分与凝血酶相似的多功能蛋白酶。在凝血过程中发挥重要作用（包括凝血与抗栓），故被命名为蛇毒类凝血酶。第2页,共47页，2024年2月25日，星期天蛇毒类凝血酶（二）现有40余种类凝血酶被分离与鉴定具有相同活性部位序列模序

﹡57位组氨酸﹡102位天东氨酸﹡195位丝氨酸

与蛇毒类凝血酶相对应的哺乳动物的相似物为胰蛋白酶。影响止血过程的多个环节

﹡凝血因子活化﹡血小板聚集的诱导﹡与神经以及补体系统功能相关第3页,共47页，2024年2月25日，星期天蛇毒类凝血酶（三）主要来源于响尾蛇亚科分布于下列科属

﹡蝮蛇属﹡响尾蛇属﹡黄颌蝮蛇属﹡具窍蝮蛇属﹡叶林蝮蛇属﹡亚洲腹属第4页,共47页，2024年2月25日，星期天蛇毒类凝血酶（四）对凝血过程的影响（一）体外具有与凝血酶类似活性－使血液凝固，所以称之为类凝血酶（Thrombin-LikeEnzeme简称TLE)。机制：催化纤维蛋白原分子特定部位Arg-Gly的裂介释放出血纤肽导致纤维蛋白单位首尾聚合物而凝固。第5页,共47页，2024年2月25日，星期天蛇毒类凝血酶（五）对凝血过程的影响（二）体内表现为抗凝作用机制：体内不激活凝血因子ⅩⅢ可不通过体内各种凝血因子，直接使纤维蛋白原凝聚，生成纤维蛋白凝块，不产生侧链交联，易被网状内皮系统或正常纤溶作用清除，故表现为抗凝作用。第6页,共47页，2024年2月25日，星期天蛇毒类凝血酶（六）对凝血过程的影响（三）由于蛇毒类凝血酶对凝血过程作用多样性，故根据蛇毒类凝血酶特性，分为下列二大类：作用

﹡促凝作用

﹡抗凝、溶栓作用分类

﹡血凝酶－巴曲酶

﹡降纤、溶血作用类凝血酶第7页,共47页，2024年2月25日，星期天巴曲酶分类1936年奥地利学者Klobusitzky和Konig首次从巴西矛头蝮蛇酶（Bothropsatnox）分离得到一种具有促凝特性的类凝血酶，先命名为凝酶，后由世界卫生组织命名为巴曲酶（Batroxobin）。国际血栓形成与止血委员会确定血凝酶（Hemocoagulase）专指从巴西矛头蝮蛇蛇毒内分离提取的巴曲酶和微量FXA组成的复方制剂，在体内发挥止血作用。第8页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶和白眉蛇毒血凝酶（类血凝酶）的对比（一）血凝酶商品名：巴曲亭或立止血定义：是指从巴西矛头蝮蛇蛇毒内分离提取的巴曲酶制剂，含微量的磷脂依赖性凝血因子X激活物（FXA）止血特点：是止血的经验性首选药物,止血安全、迅速第9页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶和白眉蛇毒血凝酶（类血凝酶）的对比（二）白眉蛇毒血凝酶原名：注射用白眉蛇毒凝血酶商品名：邦亭原料来源：长白山白眉蝮蛇的毒液组成成分：含有类凝血酶和类凝血激酶的复合制剂第10页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶和白眉蛇毒血凝酶（类血凝酶）的对比（三）二者对比分析组成成分质量标准作用机制第11页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶和白眉蛇毒血凝酶（类血凝酶）的对比（四）组成成分－血凝酶巴曲酶和微量的FXA巴曲酶的相对分子质量为39000－43000，由17种氨基酸组成，总氨基酸数为231个，纯度在90％以上，5µg电泳呈一条带，是一种单链糖蛋白FXA纯度为0.5%，相对分子质量为79000±5000第12页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶和白眉蛇毒血凝酶（类血凝酶）的对比（五）组成成分－白眉蛇毒血凝酶SDS－PAGE电泳检测含有3种组分,由类凝血酶、类凝血激酶和未知成分组成相对分子质量分别为54000±5000，34000±5000和15000±3000,相对百分含量为7.0%～12.0%，76.0%～82.0%和7.0%～12.0%,但并未明确指类凝血酶或类凝血激酶所对应的组分，也未见有类凝血激酶的相关报道第13页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶和白眉蛇毒血凝酶（类血凝酶）的对比（六）组成成分－白眉蛇毒血凝酶长白山白眉蝮蛇[Agkistrodonhalys(pallas)]蛇毒中存在2种与凝血相关物质其一为类凝血酶(thrombinlike),是单链糖蛋白,相对分子质量为43000,总氨基酸数为236个另一种为凝血酶原激活物(prothrombinactivator),相对分子质量为63000两者有着不同于矛头蝮蛇中相应成分的酶学性质特别是类凝血酶,对纤维蛋白原的降解机制与巴曲酶是截然不同的。第14页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶和白眉蛇毒血凝酶（类血凝酶）的对比（七）N末端氨基酸巴曲酶：VIGGDECDINEHPFLAFMYYSPRYFCGMTL白眉蝮蛇类凝血酶：MVIGGDECNINEHRFLVALYTSRTLFCGGT二者有一定程度的同源性，68％但是从根本上说两者是完全不同的2种物质第15页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶和白眉蛇毒血凝酶（类血凝酶）的对比（八）作用机制－血凝酶血凝酶中的巴曲酶能使纤维蛋白原Aa链上的Arg16－Gly17处降解,释放出纤维蛋白肽A,生成不稳定的可溶性的纤维蛋白I单体,在血管破损处的可溶性纤维蛋白I单体聚合成纤维蛋白I多聚体,纤维蛋白I多聚体能促进血管破损处的血小板聚集,加速血小板止血栓形成,并在血管破损处生理性止血过程形成的凝血酶作用下纤维蛋白I迅速降解释放出纤维蛋白肽B,从而生成可溶性纤维蛋白II单体,后者在凝血因子XIIIa及Ca2+作用下交联聚合成难溶性纤维蛋白(F)丝,交织成网,网罗血浆血细胞等,起止血作用。血凝酶内的FXA在血管破损处可激活凝血X因子为有活性的凝血因子X,从而间接促进凝血酶原转变为凝血酶达到迅速止血效应。第16页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶和白眉蛇毒血凝酶（类血凝酶）的对比（九）作用机制－血凝酶第17页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶和白眉蛇毒血凝酶（类血凝酶）的对比（十）作用机制－白眉蛇毒血凝酶其说明书中没有说明白眉蛇毒血凝酶其中的类凝血酶是如何作用于纤维蛋白原的实际上大部分蛇毒类凝血酶仅裂解纤维蛋白肽A,部分蛇毒类凝血酶不但裂解纤维蛋白肽A,同时还裂解纤维蛋白肽B。优先裂解纤维蛋白肽A,随后释放纤维蛋白肽B的类凝血酶与凝血酶非常相似白眉蛇毒血凝酶内的类凝血酶虽然具有和巴曲酶同样的体外凝结血浆作用,但是2种酶在这一点上的机制却是相反的第18页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶和白眉蛇毒血凝酶（类血凝酶）的对比（十一）作用机制－白眉蛇毒血凝酶血流动力学分析显示,白眉蛇毒血凝酶中的类凝血酶作用纤维蛋白原优先释放纤维蛋白肽B,经过一段延滞期后才是纤维蛋白肽A的释放。失去了纤维蛋白肽B的纤维蛋白,其释放纤维蛋白肽A的速度降低,从而影响纤维蛋白单体的聚合,使形成的凝块更为脆弱。随之产生的凝血机制与巴曲酶势必是不同的。第19页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶和白眉蛇毒血凝酶（类血凝酶）的对比（十二）作用机制－白眉蛇毒血凝酶其内的类凝血激酶是能够促进凝血酶原激活为凝血酶,从而促进血液凝固的一类酶它是一种金属蛋白酶,很容易被乙二胺四乙酸(EDTA)所抑制纯化后的“类凝血激酶”不能作用于其他凝血因子,如凝血因子X,也不能水解纤维蛋白原第20页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶和白眉蛇毒血凝酶（类血凝酶）的对比（十三）质量标准鉴别项－血凝酶根据蛇毒血凝酶质量标准[WS-349(X-317)-2001],血凝酶的鉴别项规定:每支加水0.5mL溶解后,取0.1mL加0.3mL人枸橼酸血浆,应在30s内凝固。第21页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶和白眉蛇毒血凝酶（类血凝酶）的对比（十四）质量标准鉴别项－白眉蛇毒血凝酶注射用白眉蛇毒凝血酶质量标准[WS-447(X-398)-2001]中白眉蛇毒血凝酶的鉴别项规定:取本品1支,加水1mL溶解,取0.2mL加入0.2mL人血浆,置于37℃水浴中应在1min内凝固,加入5moL.L-1尿素溶液1mL,振摇,凝块应在3min内溶解此种鉴别的方法与降纤酶质量标准[WS1-XG-031-2000]中降纤酶的鉴别项原理和方法基本相同第22页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶和白眉蛇毒血凝酶（类血凝酶）的对比（十五）质量标准控制关键性指标血凝酶的纯度测定项规定应出现1条电泳带,相对分子质量为36000±5000白眉蛇毒血凝酶的纯度测定项规定应出现3条电泳带,相对分子质量分别为54000±5000,34000±5000和15000±3000第23页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶和白眉蛇毒血凝酶（类血凝酶）的对比（十六）结论综上提示白眉蛇毒血凝酶与血凝酶不是同一种药品,而是另外一种从蛇毒提取的含有类凝血酶和类凝血激酶的具有止血作用的多种组分复合制剂,其临床疗效和全性需进一步研究和大量实验证明。据有关报道,白眉蛇毒提取物可激活凝血因子XIII,有导致弥漫性血管内凝血(DIC)的危险。因此，为了保证广大人民用药安全,有关白眉蛇毒血凝酶的使用问题不能简单只根据它的名称认为其为“血凝酶”。第24页,共47页，2024年2月25日，星期天几种蛇毒制剂不同点第25页,共47页，2024年2月25日，星期天几种蛇毒类凝血酶N端15个氨基酸序列表第26页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶的临床药理（一）血凝酶的酶学特征血凝酶为单链糖蛋白，由17种氨基酸组成，总氨基酸数为231个，它的分子量为43000(SDS),等电点在6～7之间，分子中含6个二硫键、27%的碳水化合物，碳水化合物由己糖、葡萄糖胺和唾液酸组成，糖蛋白由17种氨基酸组成。第27页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶的临床药理（二）血凝酶的稳定性与活性血凝酶在20℃时，pH为2.5—9的水溶液中数小时仍很稳定；在100℃甘油中加热一小时，其活性仍无变化；血凝酶制剂的冻干品在25℃以下，可以长期保存。每支血凝酶（巴曲亭）含量为1克氏单位。1单位的巴曲亭冻干粉注射剂是指在37℃下，其溶液1ml能使1ml含枸橼酸的标准人体血浆在60秒发生凝结的酶活性量。第28页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶的临床药理（三）血凝酶药效学研究

注射用血凝酶对家兔纤维蛋白原含量影响

组别n

纤维蛋白原（mg/dl）

给药前

给药后3小时

给药后3天空白对照组8245.50±21.13252.20±27.38249.22±25.56巴曲亭0.05ku/kg8241.57±21.98208.75±22.83252.24±21.600.1ku/kg8252.81±19.68193.60±24.91*238.35±17.320.2ku/kg8249.60±21.24175.50±23.69*251.50±27.44立止血0.1ku/kg8251.20±12.00191.20±30.48*239.20±21.78第29页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶的临床药理（四）注射用血凝酶对家兔全血凝固时间的影响组别n

全血凝固时间（秒）

给药前

给药后3小时

给药后3天空白对照组8136.40±69.44142.80±50.65132.00±64.66巴曲亭0.05ku/kg8128.00±35.3056.00±35.21*122.50±57.600.1ku/kg8135.10±35.3051.29±28.66*142.47±66.030.2ku/kg8143.20±58.3240.40±17.30*135.75±54.05立止血0.1ku/kg8129.06±27.3949.50±25.57*139.69±60.01第30页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶的临床药理（五）注射用血凝酶对血小板数量的影响组别n

家兔血小板数量（109/L）

给药前给药后1小时给药后3小时空白对照组8693.83±96.73610.40±114.64695.40±116.55巴曲亭0.05ku/kg8657.40±83.37622.20±108.82608.50±79.970.1ku/kg8661.80±164.71659.40±98.21663.30±114.030.2ku/kg8696.00±175.01651.40±203.10683.80±116.96立止血0.1ku/kg8687.40±190.57656.80±140.92610.80±91.32第31页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶的临床药理（六）血凝酶毒理研究

对小鼠进行急性毒性试验未能测出LD50。给血凝酶的最大浓度40ku/kg，最大给药容积为0.44ml/只，相当人体剂量的倍数2000，给药后小鼠活动减少，或闭目思睡状，10—15分钟逐渐恢复正常活动，连续观察7日，小鼠活动、饮食、毛色光泽均恢复正常。用灵长类动物黄狒狒作亚急性或慢性毒性试验，每天每公斤体重静脉注射0.03、0.3、3ku,共三个月试验，一切正常，对尿常规、血常规及血液生化的检查，均未见有任何变化。说明血凝酶制剂亚急性或慢性毒性也非常小。第32页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶的临床药理（七）血凝酶药代动力学血液中的血凝酶能与血浆α2-巨球蛋白结合成无活性的复合物，迅速从血液循环中清除而被肝、脾、肾中的单核巨嗜细胞系统摄取、代谢，其代谢产物由肾脏排泄，3-4天后全部消除。动物实验（狗）表明巴曲亭的半衰期3-10小时，无蓄积作用（中国药房1996，7：137-138）。

巴曲亭在体内的起效和作用维持时间取决于给药途径。

给药途径起效时间峰值出现时间峰值维持时间作用消失时间

静脉注射5-10min20-30min2h24h

肌肉注射20-30min45min24h36-72h

第33页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶的临床药理（八）巴曲亭作用机理（一）第34页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶的临床药理（九）巴曲亭作用机理（二）第35页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶的临床药理（十）第36页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶的临床药理（十一）纤维蛋白原FImFIIm纤维蛋白凝块去A肽去B肽XIII凝血酶立止血纤维蛋白原FImFIIm纤维蛋白凝块去A肽去B肽XIII凝血酶巴曲亭凝血酶矛头蝮蛇巴曲酶FXA纤维蛋白原FImFIIm纤维蛋白凝块去A肽去B肽XIII凝血酶立止血纤维蛋白原FImFIIm纤维蛋白凝块去肽去B肽XIII凝血酶巴曲亭凝血酶矛头蝮蛇巴曲酶FXA第37页,共47页，2024年2月25日，星期天血凝酶的临床药理（十二）血凝酶不会在正常血管系统内形成血栓

►由于没有凝血酶的产生，纤维蛋白Ⅰ单体不会生成纤维蛋白Ⅱ单体，也不会有纤维蛋白Ⅱ多聚体及难溶性纤维蛋白丝的产生►血凝酶的凝血作用只有在生成的FIm与Fg的比例大于1:5时才会出现。在血管损伤处由于血小板聚集而使血流减弱,Fg数量因此减少,而巴曲酶能使Fg裂解出FIm又进一步使其减少,在它的持续作用下,Fg不断减少,FIm不断增加并最终使FIm与Fg的比例大于1:5而产生血凝块。►纤维蛋白Ⅰ多聚体可被内皮网状系统吞噬，并诱导t-PA激活纤溶酶原形成纤溶酶，被纤溶酶裂解为降解产物（FDP），从而预防血管内凝血。►不释放凝血因子Ⅲ，无血小板磷脂反应表面暴露，凝血因子Ⅹ不会被激活，不会生成凝血酶第38页,共47页，2024年2月25日，星期天

血凝酶的命名第39页,共47页，2024年2月25日，星期天卫生部最新法规处方管理办法（中华人民共和国卫生部令第53号）

2007－2－14处方常用药品通用名目录

2007－3－16卫生部关于印发处方常用药品通用名目录的通知

2007－3－26第40页,共47页，2024年2月25日，星期天标准的通用名指南国家基本药物

新编药物学（16版）

《马丁代尔》大药典

中国药品通用名称国际非专利药品名（INN）第41页,共47页，2024年2月25日，星期天“血凝酶”的命名原则新编药物学

16版568页

血凝酶【基】Hemocoagulase血凝酶是以从巴西矛头蛇（Bothropsatrox,又称大具窍蝮蛇）的毒液