小鼠骨髓细胞的染色体制备

小鼠骨髓细胞的染色体制备

实验目的与要求掌握低渗法制备动物骨髓细胞染色体的方法。观察小白鼠染色体的形态特征和染色体数目，并验证实验小鼠的雌雄。实验原理秋水仙素可破坏骨髓细胞分裂过程中纺锤体的形成，把分裂的细胞阻截在中期，此时染色体达到最大收缩，具有典型的形态和特征。通过对小鼠骨髓细胞的低渗、滴片、染色等处理，可观察小鼠染色体。低渗使细胞膨胀，染色体松散；高空滴片时染色体进一步完全散开；再通过冷热处理；使细胞膜及核膜破裂。实验材料、器材和所需药品健康小白鼠（雌雄均可）、解剖刀、解剖盘、解剖剪、镊子、吸管注射器（5-10mL）、离心管（10mL）、烧杯（100mL）、37℃恒温水浴锅、普通离心机、显微镜、1:10的Giemsa磷酸盐缓冲液、秋水仙素（浓度为0.01%）、KCl（浓度为0.075mol/L）、生理盐水(浓度为0.85%)、固定液（甲醇：醋酸=3:1）、冰冻载玻片、吸管、量筒、酒精灯、吸水纸、擦镜纸实验步骤预处理→取股骨→冲洗骨髓→离心→低渗→离心→固定→离心→滴片→染色→观察

实验方法秋水仙素注射：选择健康的小白鼠（约20g重），在实验前约2-3h，按2-4ug/g体重的剂量经腹腔注射秋水仙素。断颈法处死小鼠。2、取股骨：用解剖剪刀剪取小鼠大腿骨，用剪刀剔除掉肌肉（尽量剔除干净！）。3、低渗：将剔除掉肌肉的2个腿骨放于培养皿（盛有预先于37℃温育的2mL的KCl溶液）中，用剪刀将腿骨剪碎（尽量剪得很碎！），然后低渗处理15min。4、将低渗后的上清液（不要骨头）倒入离心管，再加入1mL固定液，平衡后放入离心机，以1500r/min离心6min。5、第一次固定：弃上清，沉淀再加入3mL固定液，吹打匀，静置固定10min，平衡后放入离心机，以1500r/min离心6min。6、第二次固定：弃上清，再加入3mL固定液，吹打匀，静置固定10min，平衡后放入离心机，以1500r/min离心6min。7、制备细胞悬浮液：弃上清，将上清液倒尽，加入0.5mL固定液，用枪吹打开。8.滴片：用镊子取预先冰冻的干净载玻片，用吸管将溶液迅速滴上2-3滴细胞悬浮液，立即用另一载波片将溶液展开，使细胞分散均匀，然后晾干，或置酒精灯上微微加热干燥。共滴2张片。9、染色：将晾干后的载波片滴加染色液2-3滴覆盖样品、染色15min。10、染色后,水洗，凉干后即可镜检。。11、镜检：在低倍镜下找到中期分裂相的细胞，转用高倍镜，选择染色体分散适度、长度适中的分裂相进行观察。制备方法包括以下几个要点:

1.用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期,使中期染色体停留在赤道面处。

2.用低渗法使将细胞膨胀,以至于在滴片时细胞被胀破,使细胞的染色体铺展到载玻片上。

3.空气干燥法可使细胞的染色体在载片上展平,经Giemsa染色后便可观察到染色体的显微图象。

五、注意事项

低渗与离心等步骤的操作要轻。

观察细胞的标准为：

1．细胞完整，轮廓清晰，染色体分布在同一水平面上。

2．染色体形态和分布良好。

3．最好无重叠，即使有个别重叠，也要能明确辩认，以免差错。

4．所观察的细胞处于同一有丝分裂阶段，即染色体螺旋化程度或染色体长短大致一样。

肿瘤细胞染色体制备与观察

实验原理、实验材料、器材和所需药品：见小鼠骨髓细胞染色体标本的制备与分析实验实验方法1、肿瘤细胞株接种于小鼠腹腔，在实验前约3-4h，按2-4ug/g体重的剂量经腹腔注射秋水仙素。断颈法处死小鼠。2、收集肿瘤细胞腹水，倒入离心管内，稀释至50ml。3、取上述细胞液1ml，离心6分钟(1500r/min)，收集沉淀物，弃去上清液。加低渗KCl处理15min。离心→低渗→离心→固定