形态学实验-免疫组织化学实验

免疫组织化学实验实验目的：掌握免疫组化的基本步骤观察并分析免疫组化结果实验原理：抗原抗体反应;标记化学反应;呈色化学反应实验用品：器材：湿盒；移液枪；眼科镊；普通镊子、盖玻片、微波炉等

试剂：免疫组化试剂盒、抗体、过氧化氢等

材料：石蜡切片（心肝脾肺肾结肠骨骼肌等）操作流程：

制片---脱蜡---水化---抗原修复---H2O2封闭内源性过氧化物酶---血清封闭一抗孵育---二抗孵育---显色---复染----脱水---封片---镜检

1，切片水化脱蜡-水化：石蜡切片脱蜡、复水（与前述脱水步骤相反）即二甲苯10min、二甲苯/乙醇5min、

100%乙醇2min、100%乙醇2min、

95%乙醇2min、

85%乙醇2min、

70%乙醇2min、蒸馏水2min

实验步骤：

-适应于大部分福尔马林固定的标本1，取一定量0.01mol/L柠檬酸缓冲液（pH6.0）（800ml）于烧杯中，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入微波炉沸腾（90%火力，12min）。2，50%火力继续微波处理10min。3，取出烧杯自然冷却至室温，取出玻片，用蒸馏水淋洗后，再用PBS（pH=7.2-7.4）漂洗2次，每次3min。

--冷却时间配制抗体与过氧化氢酶阻断剂2，抗原修复--柠檬酸缓冲液微波抗原修复法配制过氧化氢酶阻断剂3%H2O2(30%H2O2-80%甲醇配制)一抗：PBS配制1:200；1:50（1）双氧水孵育：

滴加30ul（试剂A）过氧化氢酶阻断剂3%H2O2，以阻断内源性过氧化物酶的活性。室温孵育10min。（2）PBS充分淋洗，用滤纸吸干(甩干）。（3）封闭：加30ul的非免疫性动物血清或者10%羊血清（试剂B）室温封闭10min，弃封闭液（用滤纸吸干）。（4）结合一抗：加30ul的第一抗体(兔抗E-cadherin/LaminB/Actin),

按黑板上要求选择抗体，阴性对照：PBS代替一抗做空白对照）,室温孵育30min。3，按照免疫组化试剂盒说明书或PPT操作（每次要求完全覆盖）（5）PBS充分淋洗，用滤纸吸干(甩干）（6）结合二抗：加30ul的生物素标记的第二抗体（试剂C），室温下孵育10min。（7）PBS充分淋洗，用滤纸吸干(甩干）。

（8）结合HRP：加30ul的链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液（试剂D），室温孵育10min。（9）PBS充分淋洗，用滤纸吸干(甩干）。（10）DAB显色：加30ul新鲜配制DAB，室温孵育5min。（11）用PBS终止。（12）复染：苏木素复染25min，自来水冲洗反蓝10min。（13)脱水透明：乙醇梯度脱水（第13-17缸），二甲苯透明（第18-19缸）。

(14)封片：中性树脂封片。

(15)观察并上交作业：显微镜观察，切片作为作业交给老师。（1）Ab滴片技术：所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。［注意］滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。要领：甩净/擦干组织周围的水。

（2）PBS洗涤技术洗涤的目的：①保证离子浓度和PH值；②减少非特异反应。方法：洗三次，每次3-5分钟。（3）光镜控制显色方法（DAB）：室内操作：注意温度与时间的关系，室温最宜5分钟；染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后颜色可加深。技巧：合(1)福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭。

(2)甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖，这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好是进行反应。AR就是用胰蛋白酶、尿素、表面活性剂、微波缓冲液和金属盐等，通过机械的方法断开因福尔马林固定的导致的抗原表位和不相关蛋白间的交联键，使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢复，使抗体更好的渗透与表位结。为什么要进行抗原修复？---抗原修复(Antigenretrieval，AR)技术组织中非抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色，最常见原因是蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上。最有效的方法是在用第一抗体前加制备第二抗体动物的非免疫血清（1:5-1:20）封闭组织上带电荷基团，而除去与第一抗体非特异性结合。必要时可加入2%-5%的牛血清白蛋白（BSA）或明胶（Gelatin）可进一步减少非特异性染色。作用时间为10-20min。也可用除制备第一抗体以外的其他动物血清（非免疫）。不能使用一抗同物种血清，因为里面含有同物种抗体，可被二抗辨识。为什么封闭？要求是什么？成色质浓度和孵育时间可调节，增加成色质的量和/或增加底物孵育时间，可增加反应产物强度。着色太深可减少孵育时间；过氧化物酶显色时，过氧化氢加大浓度将使显色反应过快而至背景过深；过量的过氧化氢可能抑制酶的活性。显色反应的控制：阳性细胞特征：（1）可分布于细胞核、细胞浆和细胞膜；大部分见于细胞浆，可见于整个细胞浆和部分细胞浆（2）阳性细胞分布可分为灶性和弥漫性（3）由于细胞内含抗原量不同，所以染色强度不一。如果细胞之间染色强度一致，常提示其反应为非特异（4）阳性细胞染色定位于细胞，且与阴性细胞相互交杂分布；非特异染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞