脓汁和粪便标本中病原菌的检测

脓汁和粪便标本中病原菌的检测微生物学实验室规则

LabSafetyRegulation

进入实验室必须穿白大衣，戴帽子。书本、文具放在抽屉里。实验室内不准吃东西、喝饮料，不准把任何东西放入嘴中，也不要用手抚摸头脸等部位。凡是废弃的细菌培养物、带菌材料，应放在指定地点等待灭菌处理，不得随便乱放或用水冲洗。一旦发生意外，造成污染，应立即报告老师进行处理。离开实验室前,必须洗手。怀疑污染应及时用1‰新洁而灭泡手。每次实验后，实验台用消毒液擦拭，地板先用湿的拖布拖地以后再扫地，实验室用紫外线灯照射1小时。第2页,共55页，2024年2月25日，星期天实验分组（45人）俩俩相对4人为一个小组,组号编在电源插座上。每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲乙丙丁。甲乙

4丙丁甲乙

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2丙丁甲乙

1丙丁甲乙

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讲台左右11甲乙丙丁戊第3页,共55页，2024年2月25日，星期天实验分组（40人）俩俩相对4人为一个小组,组号编在电源插座上。每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲、乙、丙、丁。甲乙

4丙丁甲乙

3丙丁甲乙

2丙丁甲乙

1丙丁甲乙

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8丙丁甲乙

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9丙丁

讲台左右第4页,共55页，2024年2月25日，星期天实验分组（36人）俩俩相对4人为一个小组,组号编在电源插座上。每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲、乙、丙、丁。甲乙

4丙丁甲乙

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甲乙

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讲台左右第5页,共55页，2024年2月25日，星期天实验分组（32人）俩俩相对4人为一个小组,组号编在电源插座上。每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲、乙、丙、丁。甲乙

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讲台左右第6页,共55页，2024年2月25日，星期天实验室器材介绍第7页,共55页，2024年2月25日，星期天常用器材摆放顺序：电源插座→试管架→酒精灯→污物盘。试管架上器材：靠近插座一侧第1列放置接种针,第2列放置接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。※器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。第8页,共55页，2024年2月25日，星期天普通冰箱(3颗星***)冷藏室(上柜）：温度4～8℃，保存细菌培养物，培养基，常用菌种和抗菌素纸片等。冷冻室（下柜）：温度－18℃，保存诊断血清、血浆，长期保藏的抗菌素纸片。

卫生工具：扫帚,拖布,撮箕,垃圾筐,放在冰箱和水池之间。第9页,共55页，2024年2月25日，星期天隔水式电热恒温培养箱：35～37℃，一般细菌培养时间为18～24小时。第10页,共55页，2024年2月25日，星期天奥林巴斯CX21型生物显微镜（实验柜内，每人一台）注意：只能横放，不得竖放。第11页,共55页，2024年2月25日，星期天革兰染色瓶染色架石蜡油拭镜纸吸水纸乙醇乙醚微生物学器材柜-1（西侧边台中段）电炉→右侧柜内第12页,共55页，2024年2月25日，星期天微生物学器材柜-2（东侧边台中段）酒精棉球碘酒棉球镊子电炉、石棉网手套第13页,共55页，2024年2月25日，星期天1500W电炉▲安全警告1.电源插塞与电炉插孔接触良好→插头插入插座。2.如果培养基暴沸溢出，流入电炉；必须立即切断电源、拔除插头；以免触电，危及生命！东西两侧边台各一个电炉，每个电炉可同时放置4个300ml锥形瓶进行加热。第14页,共55页，2024年2月25日，星期天蒸馏水：配制培养基。1‰新洁而灭：怀疑病原菌污染，泡手3～5分钟。消毒液：擦拭实验台台面。玻片缸：浸泡用过的载玻片。第15页,共55页，2024年2月25日，星期天医学微生物学实验

综合性实验一

ComprehensiveExperiment1

脓汁和粪便标本中病原菌的检测（P2）

Isolationanddetectionofpathogenicbacteriainpusandstoolspecimens

培养基的制备P2消毒与灭菌P5细菌的人工培养无菌技术（录像）摆斜面，倾注平板。第16页,共55页，2024年2月25日，星期天脓汁、痰、咽部分泌物观察菌落特征、溶血性、色素肉汤增菌培养挑取可疑菌落涂片染色镜检血平板培养直接涂片、革兰染色、镜检血液、穿刺液纯培养培养液涂片染色境检染色镜检生化反应血清学鉴定双糖铁培养基增菌培养血、骨髓挑取可疑菌落SS琼脂、伊红美蓝平板分离培养粪便常见肠道致病菌的检查程序P48：常见病原性球菌的检查程序P47：生化反应动物实验药敏实验第17页,共55页，2024年2月25日，星期天脓汁和粪便标本中病原菌的检测

实验流程(6次课12学时）①培养基的制备②细菌的分离培养③细菌的纯培养④细菌的形态学检查⑤细菌的生化试验等⑥细菌的血清学试验、结果分析→实验论文撰写第18页,共55页，2024年2月25日，星期天培养基的制备

Preparationof

CultureMedia组号培养基称量水量煮沸分装备注（45人份）1，11营养琼脂11.4g300ml--4瓶，500ml瓶，平板2～4营养琼脂3.0g80ml3次5ml16支×3，中试管，斜面5～7营养肉汤1.1g50ml1次3ml16支×3，小试管，肉汤8～10半固体琼脂1.9g65ml3次4ml16支×3，小试管，高层※公共培基，勿作标记！第19页,共55页，2024年2月25日，星期天培养基的制备

Preparationof

CultureMedia组号培养基称量水量煮沸分装备注（40人份）1营养琼脂11.4g300ml--4瓶，500ml瓶，平板2～4营养琼脂2.9g75ml3次5ml15支×3，中试管，斜面5～7营养肉汤1.1g50ml1次3ml15支×3，小试管，肉汤8～10半固体琼脂1.7g60ml3次4ml15支×3，小试管，高层※公共培基，勿作标记！第20页,共55页，2024年2月25日，星期天培养基的制备

Preparationof

CultureMedia组号培养基称量水量煮沸分装备注（36人份）1营养琼脂11.4g300ml--3瓶，500ml瓶，平板2～4营养琼脂2.7g70ml3次5ml14支×3，中试管，斜面6～7营养肉汤1.3g60ml1次3ml20支×2，小试管，肉汤8～10半固体琼脂1.7g60ml3次4ml14支×3，小试管，高层※公共培基，勿作标记！第21页,共55页，2024年2月25日，星期天培养基的制备

Preparationof

CultureMedia组号培养基称量水量煮沸分装备注（32人份）1营养琼脂11.4g300ml--3瓶，500ml瓶，平板2～4营养琼脂2.3g60ml35ml12支×3，中试管，斜面6、7营养肉汤1.2g55ml13ml18支×2，小试管，肉汤8、9半固体琼脂2.2g75ml34ml18支×2，小试管，高层※公共培基，勿作标记！第22页,共55页，2024年2月25日，星期天

培养基隔石棉网煮沸，使完全溶解。营养肉汤煮沸1次，含琼脂的培养基煮沸3次(煮至刚刚冒泡,立即放置台面，半分钟后再煮)。加热时,常摇动。沸腾时，不能摇动！第23页,共55页，2024年2月25日，星期天用洗耳球和刻度吸管分装培养基。棉塞1/2塞入试管口内，松紧合适。培养基趁热分装培养基装筐待灭菌放置试管筐内，罩上硫酸纸牛皮纸，用橡皮筋扎好。第24页,共55页，2024年2月25日，星期天各组边台柜子内器材量筒锥形瓶砝码干粉培养基试管筐天平第25页,共55页，2024年2月25日，星期天各组边台抽屉内器材试管刻度吸管洗耳球称量皿2个药勺厘米尺硫酸纸、牛皮纸、橡皮筋第26页,共55页，2024年2月25日，星期天

称量皿置于左、右盘，游码移至标尺左端“0”点位置上，指针应对准中线，取得平衡。否则将杠杆两端的调整螺母旋动调节平衡。

秤物时“左物右码”，砝码置右盘，物品置左盘，尽可能放在秤盘中心。天平保持干燥、清洁。用过的药勺、称量皿清洗干净。第27页,共55页，2024年2月25日，星期天

称量皿置于左盘，游码移至标尺左端“0”点位置上，指针应对准中线，取得平衡。否则将杠杆两端的调整螺母旋动调节平衡。

秤物时“左物右码”，砝码置右盘，物品置左盘，尽可能放在秤盘中心。天平保持干燥、清洁。用过的药勺、称量皿清洗干净。第28页,共55页，2024年2月25日，星期天培养基配制器材内盖盖好外盖扭紧第29页,共55页，2024年2月25日，星期天培养基制备程序

干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→集中放在试管筐里→罩上硫酸纸、牛皮纸→用橡皮筋扎好→放入讲台边的灭菌桶或灭菌筐内→送到高压蒸汽灭菌室（洗刷室）→灭菌。

※请在30分钟内完成。第30页,共55页，2024年2月25日，星期天培养基的制备

Preparationof

CultureMedia组号培养基称量水量煮沸分装备注（40人份）1营养琼脂11.4g300ml--4瓶，500ml瓶，平板2～4营养琼脂2.9g75ml3次5ml15支×3，中试管，斜面5～7营养肉汤1.1g50ml1次3ml15支×3，小试管，肉汤8～10半固体琼脂1.7g60ml3次4ml15支×3，小试管，高层※公共培基，勿作标记！第31页,共55页，2024年2月25日，星期天第32页,共55页，2024年2月25日，星期天PreparationofCulturemedia

Groupformation:FourstudentseachformonegroupTotalof10groups(10×4=40)Eachgroupwillpreparethemediaaccordingto theinstructiongiveninnextslide.第33页,共55页，2024年2月25日，星期天PreparationofCultureMediaGroupnumberNameofMediumtoprepareQuantityweightingDistilledwaterBoilDispensingquantityincontainerContainertodispense1Nutrientagar11.4g300ml－－4bottles，Petridishes2～4Nutrientagar2.9g75ml3×5ml15×3tubes，agarslants5～7Nutrientbroth1.1g50ml1×3ml15×3tubes，brothtubes8～10Semi-solidagar1.7g60ml3×4ml15×3tubes，agardeepsMeltagarintosolutioninthemicrowaveorelectricstove第34页,共55页，2024年2月25日，星期天玻璃器材的洗刷无污染器皿:洗涤剂洗刷→流水冲洗10次→晾干。病原菌污染的器材→高压蒸汽灭菌→趁热倒出污物→洗涤剂浸泡→瓶子、试管、吸管用毛刷，平皿用纱布，洗刷干净→流水冲洗10次→晾干。瓶刷试管刷吸管刷去污粉纱布第35页,共55页，2024年2月25日，星期天收拾器材，放回边台柜内，依次摆整齐!量筒锥形瓶砝码干粉培养基试管筐天平量筒→罩纸套，扎皮筋。锥形瓶→洗干净，塞棉塞，罩纸套，扎皮筋。干粉培养基→内外盖子，必须盖好扭紧！第36页,共55页，2024年2月25日，星期天收拾器材，放回抽屉内，依次摆整齐!试管刻度吸管洗耳球称量皿药勺厘米尺硫酸纸、牛皮纸、橡皮筋药勺、称量皿、刻度吸管洗刷干净，甩去水滴，放回边台抽屉内。第37页,共55页，2024年2月25日，星期天第38页,共55页，2024年2月25日，星期天细菌培养基CultureMedia

用人工的方法，将多种营养物质，根据各种微生物生长繁殖的需要而合成的一种营养制品。它的主要成分是蛋白胨、牛肉膏、氯化钠和水，pH7.4～7.6。培养基制备的一般程序：

①调配→溶化→矫正pH→分装→灭菌→检定→保存。②干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→灭菌→检定→保存。培养基的制备原则：

(1)适当的营养成分,(2)合适的酸碱度,(3)配制后必须灭菌。第39页,共55页，2024年2月25日，星期天培养基的种类（按物理性状分类）液体培养基:不含凝固剂(琼脂),用于增菌，纯培养,保种。固体培养基:含1％～2％琼脂，用于分离培养,纯培养,保种。半固体培基（琼脂高层）:含0.3％～0.5％琼脂，用于动力检测,保种。营养肉汤brothtube琼脂斜面agarslant琼脂高层agardeepDifferentformsofculturemedia.第40页,共55页，2024年2月25日，星期天培养基的种类（按用途分类）P3基础培养基:含一般细菌生长繁殖所需的基本营养成分，可作为一些特殊培养基的基础成分，如普通平板。营养培养基：在基础培养基中加入血液、生长因子等特殊成分，供营养要求较高的细菌和须要特殊生长因子的细菌生长，如血平板。增菌培养基：促进目的菌的生长，适用于含菌量较少的标本，如葡萄糖肉汤。选择培养基：在培养基中加入抑制剂抑制杂菌生长，有助于目的菌的生长，如EMB、SS平板。鉴别培养基：利用细菌分解能力及代谢产物的不同，在培养基中加入特定的作用底物和指示剂，用来试验细菌的生化反应、代谢产物，如糖发酵管。厌氧培养基：氧化还原电势低，表面用凡士林和石蜡封住，与空气隔绝，成为无氧环境，如庖肉培养基。第41页,共55页，2024年2月25日，星期天培养基的灭菌

在冷空气完全排尽的情况下，蒸汽压103.43kPa,温度可达到121.3℃,维持15～30分钟，可以杀灭包括细菌芽胞在内的所有微生物。基础培养基：121℃高压蒸汽灭菌15～30分钟。含糖培养基：115℃灭菌15分钟。鸡蛋、牛奶培养基:75～100℃30分钟，3次(1天1次)。不耐高温的液体成分：滤菌器滤过除菌EK型蔡氏滤器、G5或G6玻璃滤器、0.45um或0.22um微孔滤膜。第42页,共55页，2024年2月25日，星期天琼脂平板agarplate

含琼脂的培养基灭菌以后，冷却50～60℃（温度越高，冷凝水越多，越易污染），以无菌操作，倾注平皿10ml（直径7厘米平皿），琼脂凝固后形成琼脂平板。平板主要用于细菌的分离培养和药敏试验。平板储存待用或做细菌培养时，为什么要倒置？①防止平板水分蒸发丢失。②防止冷凝水滴于平板表面，影响单菌落形成。③……第43页,共55页，2024年2月25日，星期天琼脂斜面agarslant

含琼脂的培养基灭菌以后，趁热斜放，培基不超过试管长度的2/3，琼脂凝固以后形成一个倾斜的表面。斜面主要用于纯菌移种和菌种保存。

斜面底部的冷凝水有利于纯菌移种、菌苔形成和菌种保藏。第44页,共55页，2024年2月25日，星期天怎样检查培养基是否合格?★无菌试验：将待检培养基置于35～37℃培养箱培养24小时，无任何细菌生长为合格。★效果试验：将已知的标准参考菌株，接种于待检培养基中，检查细菌的生长繁殖状况和生化反应是否与预期的结果相符合。第45页,共55页，2024年2月25日，星期天细菌生长繁殖的方式和速度细菌繁殖方式：以二分裂方式进行无性繁殖。繁殖速度：多数20～30分钟繁殖1代，结核杆菌18～20小时繁殖一代。细菌生长繁殖曲线第46页,共55页，2024年2月25日，星期天细菌的生长曲线细菌数量的对数培养时间（小时）510152025306.06.57.07.58.08.59.0活菌数总菌数迟缓期对数生长期稳定期衰退期第47页,共55页，2024年2月25日，星期天细菌生长曲线意义迟缓期：一般1～4h，细菌代谢活跃，但不繁殖。对数期：维持4～8h，细菌快速繁殖，数目呈几何级数增加，细菌形态、染色性、生理活性最典型、对抗菌素最敏感。细菌鉴定选用此期为佳。稳定期：通常