酶工程动植物细胞培养产酶

酶工程动植物细胞培养产酶植物细胞结构第2页,共25页，2024年2月25日，星期天

植物、动物、微生物细胞的特性比较细胞种类植物细胞微生物细胞动物细胞细胞大小/um200～3001～1010～100倍增时间/h﹥120.3-6﹥15营养要求简单简单复杂光照要求大多数要求不要求不要求对剪切力敏感大多数不敏感非常敏感主要产物色素、药物、香精、酶等醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等疫苗、激素、单克隆抗体、酶等第3页,共25页，2024年2月25日，星期天三者之间的差异主要有：植物细胞>动物细胞>微生物细胞。动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。第4页,共25页，2024年2月25日，星期天一、植物细胞培养产酶从外植体中→选育植物细胞→高产稳定细胞→培养→各种产物

1.植物细胞培养的特点提高产率和产品质量缩短周期易于管理

第5页,共25页，2024年2月25日，星期天2.培养基特点

①需要大量无机盐②需多种维生素和激素③氮源一般为无机氮④一般以蔗糖为碳源应用最广的是MS培养基和LS培养基

MS培养基是1962年为烟草细胞培养而设计的培养基。LS培养基是在其基础上演变而来的。P82表3-3第6页,共25页，2024年2月25日，星期天3.培养工艺：——悬浮细胞培养⑴工艺流程外植体→细胞的获取→细胞培养→分离→纯化产物①外植体选择和处理选取那些无病虫害、生长旺盛、生长规则植株，把茎、叶、根、芽，花、果实等切成小片段或小块。用70%-75%乙醇，0.1%升汞消毒，无菌水漂洗。第7页,共25页，2024年2月25日，星期天外植体：

从植株取出，经过预处理后，用于植物组织培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或小块。愈伤组织：

将上述外植体植入诱导培养基中，于25℃左右培养一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞团。第8页,共25页，2024年2月25日，星期天水稻的外植体（幼胚）和愈伤组织外植体愈伤组织第9页,共25页，2024年2月25日，星期天②植物细胞获取直接分离法愈伤组织诱导法原生质体再生法③细胞悬浮培养：转新培养基，在生物反应器中进行培养④分离纯化：生化技术机械法酶法第10页,共25页，2024年2月25日，星期天⑵培养条件的影响与控制①温度：室温25℃②pH：微酸性范围。即pH

5.0-6.0③通气与搅拌④光照的控制：强度和时间有一定要求⑤前体的添加（饲喂）⑥刺激剂的应用第11页,共25页，2024年2月25日，星期天4.植物细胞培养产酶实例以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例(1)大蒜愈伤组织的诱导

选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后无菌水漂洗3次。在无菌条件下，切成0.5cm3的小块，植入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA的半固体MS培养基中，在25℃，600lux，12h/d光照条件下培养18d，诱导得到愈伤组织，每18天继代一次。第12页,共25页，2024年2月25日，星期天(2)大蒜悬浮细胞培养

将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA（苄基腺嘌呤）的液体MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃，600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA的液体MS培养基中，25℃,600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d。第13页,共25页，2024年2月25日，星期天(3)酶的分离纯化细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。第14页,共25页，2024年2月25日，星期天二、动物细胞培养产酶

1.动物细胞培养的特点动物细胞可以产生各种有效高价值的物质需添加抗生素（常用青霉素和链霉素联合）细胞生长速度慢细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。反应过程成本高，产品价格贵细胞具有锚地依赖性。宜采用贴壁培养原代细胞一般繁殖50代第15页,共25页，2024年2月25日，星期天2.培养方式

(1)悬浮培养(2)贴壁培养

滚瓶培养

微载体培养(microcarrierculture)(3)固定化细胞培养包埋(entrapment)和中空纤维(microencapsulation)培养第16页,共25页，2024年2月25日，星期天3.工艺控制

⑴工艺流程种质细胞（体细胞；杂交瘤细胞）分散成悬浮细胞细胞悬浮或贴壁培养收集分离纯化产物胰蛋白酶消化第17页,共25页，2024年2月25日，星期天⑵培养条件的影响与控制①温度：一般控制在36.5℃.②pH值：一般控制在7.0-7.6的微碱性范围内。③渗透压:应与细胞内渗透压相同。④溶解氧：根据情况随时调节。第18页,共25页，2024年2月25日，星期天4.产酶实例以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原激活剂为例纤溶酶原纤溶酶纤溶酶原激活剂第19页,共25页，2024年2月25日，星期天①种质细胞用胰蛋白酶处理，分散，pH7.4磷酸盐洗涤。稀释成细胞悬浮液②接种到反应器中，与37℃CO2培养箱中，长成致密单层③去培养液，用pH7.4磷酸盐冲洗细胞④换无血清Eagle培养液，继续培养⑤每3-4天，取出培养液分离纯化⑥再加新鲜Eagle培养液，继续培养⑦亲和层析进行分离第20页,共25页，2024年2月25日，星期天细胞生产滚瓶培养装置第21页,共25页，2024年2月25日，星期天第22页,共25页，2024年2月25日，星期天

第一章

作业：1.概念酶活力单位酶比活力2.酶工程的主要任务和主要内容是什么？3.写出酶活力测定的一般步骤。

第23页,共25页，2024年2月25日，星期天第二章

作业：1.概念：产物阻遏；分解代谢物阻遏；酶合成的诱导2.提高酶产量的策措施有哪些？3.试述发酵过程中对溶解氧进行控制的必要性及其依据。4.影响酶生物合成模式的主要因素是什么？5.优良产酶菌种应具备哪些条件？第24