高考一轮微生物的培养与应用

高考一轮微生物的培养与应用专题2微生物的培养与应用第四十四课时课题1～3微生物的实验培养、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数、分解纤维素的微生物的分离第2页,共120页，2024年2月25日，星期天1．微生物的分离和培养2.培养基对微生物的选择作用3.利用微生物进行发酵来生产特定的产物第3页,共120页，2024年2月25日，星期天营养物质定义作用主要来源碳源凡能提供所需碳元素的物质构成生物体的细胞物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质无机化合物(CO2、NaHCO3)，有机化合物(糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等)氮源凡能提供所需氮元素的物质合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物无机化合物(N2、NH3、铵盐、硝酸盐)，有机化合物(尿素、牛肉膏、蛋白胨等)生长因子生长必不可少的微量有机物酶和核酸的组成成分维生素、氨基酸、碱基等1．微生物的营养物质及功能

微生物的营养物质主要有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水这五大类。考点一培养基第4页,共120页，2024年2月25日，星期天(1)在微生物所需要的化合物中需要量最大的是碳源。自养微生物利用CO2或碳酸盐作为碳源（以无机碳源作为主要碳源）。而异养微生物的碳源是有机物，最常利用的是糖类(特别是葡萄糖)；(2)微生物最常利用的氮源是氨盐、硝酸盐。能把氮气作为氮源的只限于固氮菌、某些放线菌和藻类等。霉菌仅以无机氮素化合物为氮源；部分细菌不用有机氮化合物作为氮源就不能生长。(3)微生物之所以需要补充生长因子，是由于缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。

拓展提升各类微生物的营养物质的主要来源第5页,共120页，2024年2月25日，星期天几种常见微生物的营养能量来源微生物类型碳源氮源能源大肠杆菌硝化细菌根瘤菌固氮蓝藻拓展提升糖类、蛋白质等有机物蛋白质等有机物CO2NH3NH3糖类等有机物N2有机物CO2N2光能第6页,共120页，2024年2月25日，星期天培养乳酸菌——添加维生素培养霉菌——PH调至酸性培养细菌——PH调至中性或微碱性培养厌氧微生物——无氧环境【特殊要求】第7页,共120页，2024年2月25日，星期天划分标准培养基种类特点用途物理性质化学成分天然培养基含化学成分不明 确的天然物质工业生产合成培养基

培养基成分明确(用化学成分己知的化学物质配成)分类、鉴定2．培养基的种类液体培养基半固体培养基固体培养基不加凝固剂加凝固剂，如琼脂工业生产、增菌观察微生物的运动、 分类、鉴定微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种第8页,共120页，2024年2月25日，星期天划分标准培养基种类特点用途用途培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定微生物根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物，如可用伊红—美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽)选择培养基鉴别培养基第9页,共120页，2024年2月25日，星期天培养基应用加入青霉素加入高浓度食盐不加氮源不加含碳有机物的无碳培养基拓展提升几种常见的选择培养基分离酵母菌、霉菌等真菌分离金黄色葡萄球菌分离固氮菌分离自养型微生物第10页,共120页，2024年2月25日，星期天【回扣教材】考点一培养基1．培养基的定义：人们按照微生物对

的不同需求，配制出供其

的营养物质。营养物质生长繁殖2．类型：培养基按照

可分为液体培养基和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂

后，制成琼脂固体培养基，是实验室最常用的培养基之一。微生物在固体培养基表面生长，可以形成

的_。物理性质琼脂肉眼可见菌落第11页,共120页，2024年2月25日，星期天3．营养物质：各种培养基一般都含有水、____源、____源和无机盐四种营养物质。满足微生物生长还需要适宜的____(培养霉菌时需要将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将pH调至

或

性)、氧气的要求(根据微生物的需求提供有氧或无氧环境)、

物质(如培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加

等)。碳氮中性微碱特殊营养维生素pH第12页,共120页，2024年2月25日，星期天【典例精析】【例1】大肠杆菌能够在哪种培养基上生长繁殖()A．无氮培养基B．分解尿素的细菌的选择培养基C．纤维素分解菌的选择培养基D．牛肉膏蛋白胨培养基【解析】大肠杆菌为异养微生物，以糖类、蛋白质等有机物作为碳源，以蛋白质等作为氮源。D第13页,共120页，2024年2月25日，星期天1、无菌技术的概念

无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。考点二无菌技术2、无菌技术的主要内容实验操作空间消毒操作者的手、衣着消毒实验用具灭菌实验操作过程(酒精灯旁操作)第14页,共120页，2024年2月25日，星期天项目消毒灭菌条件使用较为温和的理化方法使用强烈的理化因素结果杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子适用范围实验操作的空间、操作者的衣着和手微生物的培养器皿、接种用具和培养基等常用方法煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌2．消毒与灭菌的比较第15页,共120页，2024年2月25日，星期天1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化学药剂消毒法:用70%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源4、紫外线消毒消毒的方法拓展提升第16页,共120页，2024年2月25日，星期天1、灼烧灭菌2、干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.灭菌的方法拓展提升第17页,共120页，2024年2月25日，星期天(1)高温加热灭菌原理：使细菌体内蛋白质变性，从而达到杀灭细菌的目的。

(2)化学药剂消毒原理：使细菌体内蛋白质变性，但是化学物质很难透过孢子或芽孢的坚硬外层进入细胞内，因此化学方法难以消灭孢子和芽孢。

(3)体积分数为70%的乙醇杀菌效果最好的原因：浓度过低，杀菌力弱；浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固形成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其内，影响杀菌效果。对刚洗刷后未干的器皿，可选择75%的酒精进行消毒。拓展提升第18页,共120页，2024年2月25日，星期天培养基培养皿空气接种环双手牛奶②巴氏消毒③化学消毒⑤紫外线消毒⑥高压蒸气灭菌①灼烧灭菌④干热灭菌常用的消毒方法和灭菌方法对点训练第19页,共120页，2024年2月25日，星期天考点二无菌技术【回扣教材】获得纯净培养物的关键是防止外来________的入侵，要注意以下几个方面：(1)对实验操作的_______、操作者的______和______进行_______和________。(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行________。(3)为避免周围环境中微生物的污染，____________应在酒精灯____________进行。(4)实验操作时应避免___________处理的材料用具与_________的物品相接触。杂菌空间衣着手清洁消毒灭菌实验操作火焰附近已经灭菌周围第20页,共120页，2024年2月25日，星期天【典例精析】【例2】关于灭菌和消毒的下列说法不正确的是()A．灭菌是指杀死环境中的所有微生物，包括芽孢和孢子B．灭菌和消毒实质上是相同的C．接种环用灼烧法灭菌D．常用的灭菌方法有加热法、过滤法、紫外线法、化学药品法B第21页,共120页，2024年2月25日，星期天微生物实验室培养的基本操作程序1、器具的灭菌2、培养基的配制3、培养基的灭菌4、倒平板5、微生物接种6、恒温箱中培养7、菌种的保存考点三纯化大肠杆菌和菌种的保藏第22页,共120页，2024年2月25日，星期天1、培养基的配制流程(以牛肉膏蛋白胨培养基为例)①计算：根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的比例，计算配制100mL的培养基时，各种成分的用量。②称量：准确地称取各种成分。一、大肠杆菌的纯化培养包括培养基的配制和纯化大肠杆菌两个阶段。第23页,共120页，2024年2月25日，星期天③溶化：先将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯，加入少量的水加热。当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。然后往烧杯中加入蛋白胨和氯化钠，最后加入琼脂，加热使其熔化。在此过程中不断用玻璃棒搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。当琼脂完全熔化后，补加蒸馏水至100mL。第24页,共120页，2024年2月25日，星期天④灭菌：将配制好的培养基转移到锥形瓶中加棉塞包好，放入高压灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121℃条件下，灭菌15～30min将培养皿包好后放入干热灭菌箱内，在160～170℃下灭菌2h。⑤倒平板：等培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。第25页,共120页，2024年2月25日，星期天倒平板技术第26页,共120页，2024年2月25日，星期天问题1：培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。问题2：为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。问题探讨第27页,共120页，2024年2月25日，星期天问题3：平板冷凝后，为什么要将平板倒置？问题4：在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。问题探讨第28页,共120页，2024年2月25日，星期天2、纯化大肠杆菌（1）接种：①平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面.在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落。（包括大肠杆菌的接种和培养过程）第29页,共120页，2024年2月25日，星期天第30页,共120页，2024年2月25日，星期天第31页,共120页，2024年2月25日，星期天第32页,共120页，2024年2月25日，星期天第33页,共120页，2024年2月25日，星期天第34页,共120页，2024年2月25日，星期天第35页,共120页，2024年2月25日，星期天第36页,共120页，2024年2月25日，星期天第37页,共120页，2024年2月25日，星期天问题1：为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？

答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。问题探讨第38页,共120页，2024年2月25日，星期天问题2：在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。问题3：在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。问题探讨第39页,共120页，2024年2月25日，星期天

稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。第40页,共120页，2024年2月25日，星期天第41页,共120页，2024年2月25日，星期天第42页,共120页，2024年2月25日，星期天问题：涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？答：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。问题探讨第43页,共120页，2024年2月25日，星期天(2)培养：将接种后的培养基和一个未接种的培养基(对照组)都放入37℃恒温箱中，培养12h和24h后，分别观察并记录结果。第44页,共120页，2024年2月25日，星期天大肠杆菌纯化培养的课题成果评价

（一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。第45页,共120页，2024年2月25日，星期天二、菌种的保存1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。2、长期保存：甘油冷冻管藏法第46页,共120页，2024年2月25日，星期天考点三纯化大肠杆菌以及菌种的保藏【回扣教材】1．制作牛肉膏蛋白胨固体培养基(1)方法步骤：_______、称量、溶化、__________、_________。(2)倒平板操作的步骤：计算灭菌倒平板第47页,共120页，2024年2月25日，星期天①将灭过菌的培养皿放在_________的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。②右手拿锥形瓶，将_______迅速通过火焰。③用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约10～20mL)倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。④等待平板___________，大约需5～10min。然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上。火焰旁瓶口冷却凝固第48页,共120页，2024年2月25日，星期天2．纯化大肠杆菌(1)微生物接种的方法最常用的是___________法和_______________法。(2)平板划线法是通过________在琼脂固体培养基表面__________的操作。(3)稀释涂布平板法是将_______进行一系列的______稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到_______培养基的表面，进行培养。分为_______________和______________两步。(4)用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物_______成单个_______，从而能在培养基_______形成单个的________。平板划线稀释涂布平板接种环连续划线菌液梯度琼脂固体系列稀释操作涂布平板操作分散细胞表面菌落第49页,共120页，2024年2月25日，星期天

(5)平板划线法操作步骤：①将接种环放在火焰上_______，直到接种环_______。②在火焰旁________接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞。③将_________通过火焰。④将_________的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。⑤将_________通过火焰，并塞上棉塞。灼烧烧红冷却试管口已冷却试管口第50页,共120页，2024年2月25日，星期天⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条__________，盖上皿盖。注意不要划破__________。⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的________开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意________将最后一区的划线与第一区相连。⑧将平板________放入培养箱中培养。平行线培养基末端不要倒置第51页,共120页，2024年2月25日，星期天

(6)涂布平板操作的步骤：①将_______浸在盛有酒精的烧杯中。②取_______菌液(不超过0.1mL)，滴加到培养基表面。③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上________，待酒精_______后，________8～10s。④用涂布器将菌液________地涂布在培养基表面。涂布器少量引燃燃尽冷却均匀第52页,共120页，2024年2月25日，星期天3．菌种的保存(1)对于频繁使用的菌种，可以采用______保藏的方法。①临时保藏方法将菌种接种到试管的固体___________上，在_______的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入______的冰箱中保藏。以后每________个月，都要重新将菌种从旧的培养基上________到新鲜的培养基上。②缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易_______或产生________。

临时斜面培养基合适4℃3～6转移被污染变异第53页,共120页，2024年2月25日，星期天(2)对于需要_______保存的菌种，可以采用________管藏的方法。在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后_______。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在_________的冷冻箱中保存。长期甘油灭菌－20℃第54页,共120页，2024年2月25日，星期天第55页,共120页，2024年2月25日，星期天

(1)实验过程中对培养基、培养皿、实验操作者的双手所采用的灭菌、消毒方法依次是__________________、________________、______________。(2)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是______________________________________________________________________________________________。(3)图示是利用________法进行微生物接种，把聚集的菌种逐步_________分散到培养基的表面。在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线的原因是____________________________。高压蒸汽灭菌干热灭菌化学消毒将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生平板划线稀释以免接种环温度太高，杀死菌种第56页,共120页，2024年2月25日，星期天

(4)关于图示的操作方法和结果，叙述正确的是____。A．操作前要将接种环放在火焰边灼烧灭菌B．划线操作须在火焰上进行C．在5区域中才可以得到所需菌落D．在1、2、3、4、5区域中划线前后都要对接种环灭菌(5)若要培养具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌，制备选择培养基时在基本培养基的基础上，注意__________________________和_________，其目的是__________________________。【解析】本题考查了微生物培养等知识，灭菌、接种等操作方法。D添加高浓度蔗糖(葡萄糖)调低pH提供高糖和酸性的筛选环境第57页,共120页，2024年2月25日，星期天【例4】关于大肠杆菌的叙述，正确的是()A．四环素能抑制细胞中蛋白质的合成B．经诱变育种可获得人胰岛素高产菌株C．细胞中只含有A、T、C、G四种碱基D．T2噬菌体感染菌体，不会导致菌体裂解【解析】四环素通过抑制细菌蛋白质的合成从而抑制细菌繁殖，A正确；要想获得能产生人胰岛素的高产菌株，只有通过基因工程来实现，B不正确；大肠杆菌细胞中含有DNA和RNA两种核酸，含有A、G、C、T、U五种碱基，C不正确；T2噬菌体感染菌体后，在菌体内大量增殖，则会使菌体裂解，子代噬菌体释放出来，D不正确。A第58页,共120页，2024年2月25日，星期天

1、自然界筛选：PCR技术启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制(PCR)的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。一、筛选菌株考点四筛选菌株、统计菌落数目、设置对照第59页,共120页，2024年2月25日，星期天要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，制作选择培养基；2、实验室中筛选：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。实例：此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。第60页,共120页，2024年2月25日，星期天1、显微镜直接计数：利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。二、统计菌落数目不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点：第61页,共120页，2024年2月25日，星期天2.间接计数法（活菌计数法）⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。⑵常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。第62页,共120页，2024年2月25日，星期天某同学在稀释倍数为106

的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B对点训练第63页,共120页，2024年2月25日，星期天①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出菌落平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。(3)注意事项第64页,共120页，2024年2月25日，星期天说明设置重复组的重要性。在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。三、设置对照第65页,共120页，2024年2月25日，星期天判断培养基中是否有杂菌污染：将未接种的培养基同时进行培养。判断选择培养基是否具有筛选作用：完全培养基（营养成分齐全）接种后培养观察菌落数目。主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。设置对照的作用：第66页,共120页，2024年2月25日，星期天实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。原因：⑴土样不同⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质)如何设置对照：第67页,共120页，2024年2月25日，星期天小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。第68页,共120页，2024年2月25日，星期天考点四筛选菌株、统计菌落数目、设置对照【回扣教材】1．筛选菌株(1)自然界筛选：实例：DNA多聚酶链式反应(PCR)要求使用____________________________酶。科学家从水生耐热细菌Taq中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶。耐高温的DNA聚合第69页,共120页，2024年2月25日，星期天方法：根据目的菌对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。(2)实验室中筛选：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括_______、_______、______等)，同时_______或_______其他微生物生长。(3)选择培养基在微生物学中，将允许_______种类的微生物生长，同时抑制或阻止_________微生物生长的培养基，称作_________培养基。营养温度pH抑制阻止特定其他种类选择第70页,共120页，2024年2月25日，星期天2．统计菌落数目测定微生物数量的常用方法有________________法和____________________法。3．设置对照(1)设置对照的主要目的是排除__________中_______________对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。(2)判断培养基中是否有杂菌污染：___________________________________________。(3)判断选择培养基是否具有筛选作用：____________________________________________。稀释涂布平板显微镜直接计数实验组非测试因素将未接种的培养基在相同的条件下进行培养对照培养基(营养物质齐全)接种后培养观察菌落数目第71页,共120页，2024年2月25日，星期天【典例精析】【例5】自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。实验步骤：(1)制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。(2)为了得到更加准确的结果，你选用______________法接种样品。(3)适宜温度下培养。稀释涂布平板第72页,共120页，2024年2月25日，星期天结果分析：(1)测定大肠杆菌数时，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是______，其理由是______________________________________________________________________________________________________________________________________________。A．一个平板，统计的菌落数是230B．两个平板，统计的菌落数是220和260，取平均值240C．三个平板，统计的菌落数分别是210、50和520，取平均值260D．四个平板，统计的菌落数分别是210、300、240和250，取平均值250D在设计实验时，一定要涂布至少三个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性；在分析实验结果时，要考虑所设置的重复组的结果是否合理第73页,共120页，2024年2月25日，星期天

(2)一同学在稀释倍数为105的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中的菌落数是___________(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL)。(3)用这种方法测定的大肠杆菌密度，实际活菌数量要比测得的数量______，因为______________________________________________________________________________________________。【解析】(2)每毫升样品中的菌落数＝234×105÷0.1＝2.34×108。2.34×108多当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落第74页,共120页，2024年2月25日，星期天1、尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌能利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH3考点五土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、课题基础第75页,共120页，2024年2月25日，星期天3、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。4、课题目的①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌第76页,共120页，2024年2月25日，星期天15.0g琼脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO45、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：①从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖氮源：尿素第77页,共120页，2024年2月25日，星期天

怎样证明此培养基具有选择性呢？以尿素为唯一氮源的培养基牛肉膏蛋白胨培养基

是分离尿素细菌判断该培养基有无选择性实验组对照组培养基类型是否接种

目的

结果只生长尿素细菌生长多种微生物是第78页,共120页，2024年2月25日，星期天从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。“微生物的天然培养基”[一]土壤取样数量最大、种类最多大约70%—90%是细菌◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。二、实验设计第79页,共120页，2024年2月25日，星期天[二]制备培养基

由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。

准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。还需要8个灭菌试管和1个灭菌移液管。

将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。第80页,共120页，2024年2月25日，星期天◆应在火焰旁称取土壤10g。◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行◆分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板（三） 样品的稀释第81页,共120页，2024年2月25日，星期天问题：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。第82页,共120页，2024年2月25日，星期天㈣.取样涂布◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。第83页,共120页，2024年2月25日，星期天㈤.微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：30～37℃培养1～2d放线菌：25～28℃培养5～7d霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。第84页,共120页，2024年2月25日，星期天微生物的培养与观察第85页,共120页，2024年2月25日，星期天[一]无菌操作1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。[二]做好标记注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。[三]规划时间二、操作提示第86页,共120页，2024年2月25日，星期天四.结果分析与评价1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。2.提示：选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。第87页,共120页，2024年2月25日，星期天1.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。2.测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红-美蓝培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。五.课外延伸第88页,共120页，2024年2月25日，星期天第89页,共120页，2024年2月25日，星期天大肠杆菌呈深紫色,中心有或无金属光泽大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征

第90页,共120页，2024年2月25日，星期天考点五土壤中分解尿素的细菌的分离与计数【回扣教材】1．实验设计实验设计包括________，所需_______、_______、_____________，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。实验方案仪器材料用具和药品第91页,共120页，2024年2月25日，星期天2．操作提示(1)无菌操作①取土样用的小铁铲和盛土样的信封在________都需要灭菌。②应在________称取土壤。在_______附近将称好的土样______锥形瓶中，塞好棉塞。③在______土壤溶液的过程中，每一步都要在________操作。(2)做好标记本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好在________就做好________。例如，在标记培养皿时应注明____________、_________以及平板上培养样品的________等。使用前火焰旁火焰倒入稀释火焰旁使用前标记培养基种类培养日期稀释度第92页,共120页，2024年2月25日，星期天3．课题延伸本课题对能分解尿素的细菌进行了初步的筛选。对分离纯化的菌种作进一步的鉴定，还需要借助_________的方法。在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的_______将尿素分解成了______，pH______，以尿素为唯一氮源的培养基加入____________，如果pH升高，____________，可以初步鉴定该种细菌能够分解尿素。生物化学脲酶氨升高酚红指示剂指示剂变红第93页,共120页，2024年2月25日，星期天【典例精析】

【例6】尿素是一种高浓度氮肥且长期施用没有不良影响，但尿素只有通过土壤中某些细菌分解为氨后，才能被植物吸收利用。分解尿素的细菌都能合成脲酶，脲酶能催化尿素水解。某同学要分离土壤中能分解尿素的细菌，并统计每克土壤样品中活菌数目，培养基配方如下：第94页,共120页，2024年2月25日，星期天第95页,共120页，2024年2月25日，星期天(1)根据培养基的成分判断，该同学能否分离出土壤中分解尿素的细菌？______(能/不能)，原因是_______________________________________________________________。(2)要统计每克土壤样品中活菌数目，宜采用______________法接种，根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的_________就能大约推测出样品中活菌数。【解析】本题考查微生物的选择性培养，以及微生物计数。不能培养基含蛋白胨，尿素不是唯一氮源，不能选择出只以尿素为氮源的微生物稀释涂布平板菌落数目第96页,共120页，2024年2月25日，星期天1.纤维素

纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。考点六分解纤维素的微生物的分离一、基础知识第97页,共120页，2024年2月25日，星期天

土壤中某些微生物能够产生纤维素酶,把纤维素分解为葡萄糖，后再利用。第98页,共120页，2024年2月25日，星期天2.纤维素酶

纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纤维素第99页,共120页，2024年2月25日，星期天

在2支20mL的试管中，分别放入1×6cm的滤纸条，再分别加入pH为4.8、物质的量浓度为0.1mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液10mL、11mL。在加入10mL缓冲液的试管中加入1mL纤维素酶（70~80U/mL）。将二支试管固定在50mL的锥形瓶中，在摇床上以140r/min的转速振荡反应1h，观察结果。1U表示1个酶活力单位，是指在温度为25℃，其他反应条件，如pH等，均为最适的情况下，在1min内转化1mmol的底物所需的酶量。小实验：体验纤维素酶的作用第100页,共120页，2024年2月25日，星期天在一支试管中添加纤维素酶，另一支试管不添加纤维素酶；实验分析：P27的小实验是如何构成对照的？滤纸崩溃法第101页,共120页，2024年2月25日，星期天3.纤维素分解菌的筛选①筛选纤维素分解菌的方法______________。该方法可以通过________反应直接筛选。刚果红染色法颜色

其原理是：刚果红可以与纤维素形成____________，当纤维素被_________分解后，红色复合物无法形成，出现以_____________为中心的________，可以通过___________________________来筛选纤维素分解菌。红色复合物纤维素酶纤维素分解菌透明圈是否产生透明圈第102页,共120页，2024年2月25日，星期天可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌第103页,共120页，2024年2月25日，星期天二、实验设计土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别培养基挑选菌落什么样的环境取样?①培养的目的?②选择培养基的特点?挑选什么样的菌落?①鉴别培养基的特点?②如何鉴别?根据：微生物对生存环境的要求，到相应环境中去找；目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物；刚果红染色法第104页,共120页，2024年2月25日，星期天1、纤维素分解菌选择培养基属于______（固体、液体）培养基，原因是_____

【资料二】选择培养阅读资料二“选择培养基”，回答以下几问题：液体没有添加琼脂2、该培养基对微生物_____（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是____________________________________________________________________________

具有以纤维素粉为唯一碳源，能分解纤维素的微生物可以大量繁殖；第105页,共120页，2024年2月25日，星期天若设置一个对照实验说明选择培养的作用，应控制的变量是将__________改为_________。3、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？葡萄糖纤维素粉第106页,共120页，2024年2月25日，星期天【资料三】刚果红染色法方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应方法二：在倒平板时就加入刚果红第107页,共120页，2024年2月25日，星期天培养基组成提供的主要营养物质CMC-Na5~10g碳源酵母膏1g碳源、氮源、生长因子KH2PO40.25g无机盐土豆汁100mL碳源、生长因子琼脂15g凝固剂上述物质溶解后，加蒸馏水定容至1000mL氢元素、氧元素鉴别纤维素分解菌的培养基(水溶性羧甲基纤维素钠)第108页,共120页，2024年2月25日，星期天染色法优点缺点方法一

方法二

颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用操作繁琐，刚果红会使菌落之间发生混杂操作简便，不存在菌落混杂问题

产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈，有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。思考：这两种方法各有哪些优点与不足第109页,共120页，2024年2月25日，星期天挑选产生透明圈的菌落

挑取产生明显的透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C－370C培养，可获得纯培养。第110页,共120页，2024年2月25日，星期天

培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落？

对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。

三、结果分析与评价第111页,共120页，2024年2月25日，星期天

为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_______