宏基因组学概述

PAGE2北京交通大学学报第卷宏基因组学概述王莹，马伊鸣（北京交通大学土木建筑工程学院环境1402班）摘要：随着分子生物学技术的快速发展及其在微生物生态学和环境微生物学研究中的广泛应用，促进了以环境中未培养微生物为研究对象的新兴学科——微生物环境基因组学(又叫宏基因组学、元基因组学，英文名Metagenomics)的产生和快速发展。宏基因组学通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA，构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能．在短短几年内，宏基因组学研究已渗透到各个领域，包括海洋、土壤、热液口、热泉、人体口腔及胃肠道等，并在医药、替代能源、环境修复、生物技术，农业、生物防御及伦理学等各方面显示了重要的价值。本文对宏基因组学的主要研究方法、热点内容及发展趋势进行了综述关键词：宏基因组宏基因组学环境基因组学基因文库的构建MacrosummaryofMetagenomicsWangYing,MaYi-Ming（BeijingJiaotongUniversity,Instituteofcivilengineering,）Keywords:Metagenome;Metagenomics;Theenvironmentalgenomics宏基因组学（Metagenomics）又叫微生物环境基因组学、元基因组学。它通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA,构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。它是在微生物基因组学的基础上发展起来的一种研究微生物多样性、开发新的生理活性物质（或获得新基因）的新理念和新方法。其主要含义是：对特定环境中全部微生物的总DNA（也称宏基因组，metagenomic）进行克隆，并通过构建宏基因组文库和筛选等手段获得新的生理活性物质；或者根据rDNA数据库设计引物，通过系统学分析获得该环境中微生物的遗传多样性和分子生态学信息。1.起源宏基因组学这一概念最早是在1998年由威斯康辛大学植物病理学部门的JoHandelsman等提出的，是源于将来自环境中基因集可以在某种程度上当成一个单个基因组研究分析的想法，而宏的英文是"meta-"，具有更高层组织结构和动态变化的含义。后来伯克利分校的研究人员KevinChen和LiorPachter将宏基因组定义为"应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机群落，而不需要在实验室中分离单一的菌株"的科学。2研究对象宏基因组学(Metagenomics)是将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体自上而下地研究微生物与自然环境或生物体之间的关系。宏基因组学不仅克服了微生物难以培养的困难,而且还可以结合生物信息学的方法,揭示微生物之间、微生物与环境之间相互作用的规律,大大拓展了微生物学的研究思路与方法,为从群落结构水平上全面认识微生物的生态特征和功能开辟了新的途径。目前,微生物宏基因组学已经成为微生物研究的热点和前沿,广泛应用于气候变化、水处理工程系统、极端环境、人体肠道、石油污染、生物冶金等领域,取得了一系列引人瞩目的重要成果。3研究方法宏基因组学的研究过程一般包括样品和基因(组)的富集；提取特定环境中的基因组DNA；构建宏基因组DNA文库；筛选目的基因；目的基因活性产物表达(图1)五个步骤。图1环境微生物宏基因组学研究过程Fig.1Generalprocessofmetagenomicstrategie3.1环境样品及目的基因组富集在宏基因组文库筛选过程中目的基因仅占总DNA的一小部分,对环境样品的预富集可以大大提高目的基因的检出几率。目前预富集技术主要分为细胞水平富集和基因组水平富集。其中细胞水平富集主要是通过利用选择培养基对目的微生物进行富集培养,最常用的方法是底物选择,此外还包括营养选择及物理化学指标选择。但是由于富集培养选择性地富集了具有快速生长特性的菌群,因此导致大部分物种多样性信息丢失。目前可以通过先在严格胁迫条件下短期处理,然后改为较温和的处理条件,可以从一定程度上克服这种方法的局限性。基因组水平富集常用的技术为稳定同位素探针技术(SIP),原理是采用稳定同位素标记底物,其中的“重”原子掺入到具有代谢活性的微生物核酸中,采用密度梯度离心的方法将“重”的DNA与“轻”组分分离,被标记的“重”核酸可以作为PCR的模板,用来构建宏基因组文库。例如采用C标记的甲醇研究森林土壤宏基因组DNA,结果鉴定出变形细菌α-亚纲中所有已知的嗜甲基菌,并在一种嗜酸菌中发现了新的甲醇还原酶基因。此外,还有报道利用抑制性消减杂交技术、差异显示技术、噬菌体展示技术、亲和捕获技术及DNA微阵技术等技术来富集目的基因。3.2宏基因组DNA的提取获得高浓度、大片段、无偏好的环境样品总DNA是宏基因组文库构建的难点之一。近年已有多种宏基因组DNA的提取纯化方法陆续建立起来,大体可分为两类:一类是直接提取法,又称原位提取法。这类方法不经过样品中微生物的培养和分离,通过化学法、酶解法或物理法直接破碎环境中的微生物细胞而使DNA得以释放,并对DNA进行纯化。其中以Zhou法和Tsai法最为常用。该法操作简便、省时、成本低,所获得DNA具有较好的完整性,并能够代表某一生境的微生物群落多样性。但该发放常会出现细胞裂解不完全或DNA与土壤杂质成分产生共沉淀而无法有效地去除等问题,所以一般需要进一步的DNA纯化处理,同时所提取获得的DNA片段较小(1kb~50kb),主要适用于小片段文库的构建;另一类是间接提取法,即异位提取法,是利用离心介质或者梯度离心等方法先把微生物从环境筛选到脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、乙醇氧化酶、木聚糖酶、纤维素酶及脱羧酶等酶制剂,并且在此基础上获得新酶的许多特征信息(表1)。所采用的载体种类十分广泛,包括Fosmid、Cosmid、BAC、λ噬菌体以及各种穿梭载体,所采用的宿主系统为常用的大肠杆菌、链霉菌和假单胞菌等。通过宏基因文库筛选得到的生物分子大多数与已知的基因产物相似性差或者完全是新的分子,这些新的生物分子主要来源于环境未培养微生物的基因和其多样的代谢物。环境样品DNA的克隆和筛选只是所有环境遗传信息多样性的一小部分,环境微生物和宏基因组的多样性仍旧是发现新的天然活性产物的丰富广阔资源,为研究者们探索开发新的生物催化剂提供了巨大的资源空间。新型催化剂主要是酶。传统的新型酶的筛选方法限制了筛选的广泛性和有效性。宏基因组学则克服了这一限制，有效地提高了新酶的筛选效率，现已发现了抗生素及维生素生物合成相关基因簇的克隆,以及水解酶类和氧化还原酶类编码的基因。宏基因组技术通过对环境的直接克隆，为研究和利用占微生物99%以上的非培养微生物提供了新的途径，为微生物的研究和发展提供了全新的策略。但此技术的开发利用还有许多亟待解决的问题：如上面提及的两种DNA的提取方法各有其缺陷，使获得的DNA不能完全代表样品DNA组成，这就需要进一步优化样品DNA的提取方法。另外，应根据筛选目的选用合适的载体和宿主菌。再者，文库的筛选方法有待进一步完善，对于序列筛选法来说主要是测序的速度和费用问题，功能筛选法则需克服从几万到几十万个克隆中只能筛选到几个有活性的基因的状况，应建立更为敏感的高通量筛选方法。宏基因组学技术克服了传统新型酶的筛选方法在筛选的广泛性和有效性不足这一缺点,在新型生物酶制剂的开发应用上有着长足的进步。目前已经从构建的宏基因组文库(如海底淤泥、温泉淤泥、动物粪便、动物瘤胃内容物等)成功筛选到蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、水解酶类和氧化还原酶类等酶制剂。4.3宏基因组学在医学上的应用宏基因组技术的出现为新药物的探索和发现提供了可能的技术支持,并扩大了微生物代谢产物及分子活性物质筛选平台。例如早在2000年,Wang等构建土壤宏基因组文库,通过文库筛选获得TerragineA及其相关成分,目前已广泛应用于医学治疗领域,证明了自然环境中的丰富微生物代谢产物可以通过宏基因组技术为人们所利用;同年Brady等从土壤宏基因组文库中筛选发现一种长链N-酰氨基酸抗生素物质;并在2004年构建凤梨科植物树茎流出液宏基因组文库,筛选鉴定获得了抗菌物质PalmitoylPutrescine。2001年Macneil等构建了土壤宏基因组BAC文库,通过序列分析筛选获得5个能产生抗菌小分子物质靛玉红并对其相关成分进行研究;2002年Gillespie等构建土壤宏基因组文库筛选获得两种抗菌物质TurbomycinA和B,并且发现TurbomycinA和B对革兰氏阴性和革兰氏阳性菌具有广谱抗菌活性;2003年DiazTorres等通过构建人唾液宏基因组文库,筛选获得一种新的四环素抗性基因Tet(37),该活性物质对四环素具有很好的抗性;2008年Mori等通过活性污泥宏基因组文库筛选获得两种不同的博来霉素抗性基因,经过比对发现于来源放射菌类基因差异较大,可能为新的博来霉素抗性基因。国内在利用宏基因组技术获取新型药物的研究较少,尚处于萌芽阶段,赵晶等从南极中山站排污口采集污泥,构建宏基因组文库,并通过差异性DNA修复实验(DDRT)筛选得到具有抗肿瘤效应的物质。同时利用宏基因组技术研究探讨人类肠道中不可培养微生物多样性也有了很大进展。如Kurokawa等利用宏基因组技术对13个处于不同年龄层的健康人体粪便微生物种群进行了研究，结果分析表明未断奶婴儿的肠道微生物种群在系统发育和基因组成上具有较大个体差异性，而在成人及已断奶儿童则呈现出高度的功能一致性，并对成人及婴儿肠道内编码该生境微生物主要功能的基因家族的特性进行分析，发现了一个新的人类肠道微生物基因家族和一个共扼转座子。2003年Breitbart等通过构建宏基因组文库对人体排放物中的未培养病毒多样性进行研究，经过鸟枪测序法鉴定,获得的病毒大约有1200种基因型，结果比对表明其基因序列与先前报道的病毒具有很大的差异性，大多数为新病毒,并证明这些病毒极有可能与人类的疾病有着密切的关系。2008年Finkbeiner等通过构建12个腹泻小孩肠道内容物宏基因组文库，来观察病人肠道中病毒的生物多样性，发现扩增得到的病毒序列与GenBank病毒库中的已知序列同源性很低,并推断这些病毒极有可能与人类的腹泻疾病有着密切的关系。随着宏基因组技术的成熟，必将加快宏基因组技术在医学中的应用。在人体微生物抗药性的研究,人体与不可培养病原菌的相互关系的探索等方面将做出重大贡献。宏基因组技术突破了大量微生物无法通过纯培养方法而进行研究的束缚，为新药的开发和利用提供了技术支持,相信随着宏基因组技术的成熟，该技术在发现新基因、研究人体微生物抗药性以及与不可培养病原微生物的相互关系方面做出重大贡献。4.4宏基因组学在气候变化中的应用由人类活动引起的全球气候变化问题一直备受关注。其中,温室气体特别是CO2浓度的上升引起的全球变暖问题尤其受到关注。气候变暖将对地球碳氮等物质循环、陆地及海洋生态系统功能等产生重大影响。同时,地球化学物质循环(如碳、氮、磷、硫等)也是生态系统响应气候变化的关键过程,而微生物是该循环过程的主要驱动力。近年来,宏基因组学的运用为微生物对气候变化响应和反馈的研究提供了全新的视角,并取得了相当大的进展。例如,Danovaro等的研究表明,海洋中病毒的结构、功能以及病毒与宿主的相互作用都受到全球气候变化的影响,并反作用于全球气候变化和物质循环。另外,Simister等研究了珊瑚礁微生物群落对升温的响应,发现处于生长状态的珊瑚礁上的微生物群落不受温度升高的影响,而坏死珊瑚礁上的微生物的群落结构和组成发生了改变。上述研究结果都说明微生物群落的复杂性,不同的种群有不同的反应机制,因此微生物群落的结构与功能需要进一步深入探讨。Zhou等基于功能基因芯片的长期增温实验表明,土壤微生物群落结构在增温条件下发生了显著改变,分解易降解碳的基因变得活跃,而分解难降解碳的基因并没有显著改变,保证了土壤碳存储的相对稳定。通过构建微生物的分子生态学网络,Deng等发现不同气温条件下,微生物基因在网络中扮演的角色以及相互作用规律发生了明显改变。另外,功能基因芯片也被用于研究CO2浓度升高的效应。CO2浓度升高刺激了调节重要物质循环过程基因的活性,其中碳固定基因、易降解碳基因以及氮循环基因的数量明显增多。另一方面,He(2012)基于系统发育芯片的实验发现,CO2浓度升高导致微生物可操作分类单元operationaltaxonomicunit，OTU)的丰度显著增加。将上述两种芯片分别进行网络构建后发现微生物基因间的相互作用受到CO2浓度的显著影响,且不同CO2浓度下发挥关键作用的特征基因和模块的核心基因均不同。4.5宏基因组学在水处理工程系统中的应用对水处理工程系统的微生物群落组成和功能研究,尤其是对活性污泥中微生物的研究,不仅有助于深入了解反应器处理污染物的作用机理,更可以指示反应器的性能,为系统运行提供预警和管理措施。Ye等基于Illumina高通量测序的研究揭示了不同反应器中微生物整体新陈代谢路径相似,但参与特定糖类代谢和膜运输的基因显著不同。在不同污水处理反应器和不同采样时间条件下,微生物的降解基因丰度和多样性有显著差异,这一结果为监测和评估活性污泥降解有机污染物和净化废水能力提供了重要依据。此外,Illumina技术的应用还包括对饮用水氯消毒的微生物研究。研究发现,微生物群落结构显著受到氯消毒的影响,抗性微生物和微生物的抗性基因都得到浓缩,其中变形菌(Proteobacteria)是优势抗性微生物。Ye和Zhang利用罗氏454测序技术也有效揭示了活性污泥中微生物的优势种群为研究活性污泥中的微生物群落结构组成提供了重要信息。4.6宏基因组学在石油污染中的应用如果原油或其他石油制品在开采、炼制、贮运和使用过程中进入环境,则容易造成环境污染,严重影响土壤和水的生态环境和质量,甚至危害人类健康。目前,利用微生物降解对石油污染进行生物修复越来越受到关注,其主要思路是通过调控土壤或水体的微生物生态环境,改变微生物群落结构,以提高微生物降解石油的活性和能力。对此学者已开展了对石油污染的土壤或水体中微生物群落特征的研究,希望能够找到在降解污染过程中起作用的关键微生物或功能基因。Kostka等利用高通量测序技术研究了2010年墨西哥湾石油污染事件对沿海沙滩的影响,发现石油污染对微生物群落的丰度和组成有明显的扰动,而γ变形菌(Gamma-proteobacteria)中的食碱菌属(Alcanivorax)、海杆菌属(Marinobacter)和α变形菌(Alpha-proteobacteria)中的红杆菌科(Rhodobacteraceae)中的微生物对自然清除石油污染起了关键作用。这一成果被DosSantos使用454测序的工作所部分证实,海细菌属(Marinobacterium),海杆菌属(Marinobacter)和解环菌属(Cycloclasticus)微生物种群在石油污染的土壤中丰度增加,因此这些微生物可以用来作为表征石油污染的关键指示类群。5目前遇到的问题样品的提取方法还有待改进，生物信息分析依赖于样品的复杂度。6结论鉴于99%以上的微生物无法通过培养来获得,而这些微生物中又蕴含了大量的有价值的活性物质，所以宏基因组技术的利用就显得尤为重要。所幸的是到目前为止已经利用宏基因组技术获得了许多全新的功能基因和活性物质，在药学和生物技术方面都有着重要的应用。同时我们也应该看到,作为一种新兴的技