第十一章 DNA的复制课件

第十一章

DNA的复制第一节 半保留复制的验证半保留模型（semioconservetivemodel）

全保留复制模型(conservetivemodel)

分散模型(Dispersivemodel)。第十一章DNA的复制第十一章DNA的复制验证半保留复制的实验一、Meselson-Stahl实验

二、Taylar实验

三、姐妹染色单体差别染色方法（sister-chromatiddifferentialstaining）

5溴脱氧尿嘧啶（5-Bromodeoxyuridine，简称BUdR）斑色染色体（Harlequinchromosome）四、Cairns复制模型—θ型复制

第十一章DNA的复制第十一章DNA的复制

图11-4Taylor蚕豆根尖放射自显影实验。

(a)按半保留复制预期DNA在复制过程中标记情况；(b)实验结果染色体放射自显影的图示。第十一章DNA的复制第十一章DNA的复制第十一章DNA的复制第十一章DNA的复制第二节

复制的起点、方向和终点

一.研究方法：

1.用同位素标记电镜观察及变性法2.用噬菌体插入标记法同步培养不同步培养

3.变性定性法（denaturationmapping）

4.双向电泳法第十一章DNA的复制第十一章DNA的复制第十一章DNA的复制图11-11不同步培养时各标记的拷贝数不同

复制起点标记的拷贝数应最多第十一章DNA的复制第十一章DNA的复制二、原核的复制起点和方向

E.coli定点、双向对称复制。

T7在近一端的17％处开始，向两端延伸。枯草杆菌有固定的起始点，双向不对称复制。质粒R6K早期为单向复制，复制了约1/5基因组进行时双向复制。质粒ColE1有固定起始点，但却为单向复制。

mtDNA进行D（displacedloop）环复制

真核有多个复制起点（i），双向等速复制。第十一章DNA的复制第十一章DNA的复制D环复制第十一章DNA的复制第三节

DNA复制突变型的筛选根据温度敏感性筛选同位素标记法筛选5－溴尿嘧啶掺入法质粒温度敏感性的筛选根据抗药性筛选根据与突变有关的生物学功能筛选快停突变与慢停突变第十一章DNA的复制第十一章DNA的复制第四节

原核生物复制的酶系统DNA合成酶

DNA聚合酶的共同特点是：（1）需要提供合成模板；（2）不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3'－OH；（3）合成的方向都是5‘→3’（4）除聚合DNA外还有其它功能。第十一章DNA的复制

表11-1E.coli中的三种DNA多聚酶

DNApolⅠDNApolⅡDNApolⅢ结构分子量

109KD90KD900KD构成

单体单体异多聚体分子数/细胞

400？10-20酶活性：5→3`聚合酶

+++3`→5`外切酶

+++5`→3`外切酶

+－－(可切单链)突变体突变位点polApolBpolC(dnaE),dnaN,dnaZX,dnaQ,dnaT突变表型修复有缺陷能修复阻止复制

第十一章DNA的复制(一).DNA聚合酶I的结构DNA聚合酶有6个结合位点：(1)模板结合位点；(2)引物结合位点；(3)引物3‘－OH结合位点；(4)底物dNTP结合位点；(5)5‘→3’外切酶结合位点；(6)3'→5'校正位点。第十一章DNA的复制第十一章DNA的复制第十一章DNA的复制(二).DNA聚合酶Ⅰ的功能

1.5‘→3’聚合功能

2.3‘→5’外切活性

3.5‘→3’外切活性

(1)切口平移（nicktranslation）；

(2)链的置换；

(3)模板转换（template-switching）

4.内切酶活性第十一章DNA的复制第十一章DNA的复制第十一章DNA的复制第十一章DNA的复制(三)DNA多聚酶Ⅲ的结构第十一章DNA的复制第十一章DNA的复制第十一章DNA的复制全酶在DNA上的装配分为三个阶段：（1）一个β二聚体加上一个γ复合体识别引物模板形成一种前起始复合物。（2）DNA在于β,γ复合体结合的位点构象发生改变，而对核心酶产生了高亲和。使核心酶能与DNA结合。（3）τ二聚体结合核心聚合酶，使其二聚化。第十一章DNA的复制二.DNA连接酶

其作用机制是分三步进行：1、E＋ATP→E－AMP＋ppi

在E.coli中，

E＋NAD→E－AMP＋NMN（烟酰胺单核苷酸）2、E-AMP上的AMP转移到DNA的5‘-PO4上使其活化3、活化的5‘－PO4与相邻的3’－OH作用形成3‘－5’

磷酸二酯键，并释放出AMP。第十一章DNA的复制三.单链结合蛋白又称为双螺旋去稳定蛋白（helixdestabilizingprotein）由177个aa组成在E.coli中以四聚存在分子量为74KDa在原核中SSB与DNA结合表现出协同效应。（1）SSB之间的相互作用；（2）第一个SSB和DNA的结合改变了DNA的结构。第十一章DNA的复制四.解旋酶(helicase)第十一章DNA的复制第五节原核生物，噬菌体和病毒的复制起

始和终止一.环状DNA的复制第十一章DNA的复制第十一章DNA的复制复制起始区的结构特点是：（1）富含A－T，这可能和双链易于解开起始复制有关；（2）含有多个回文结构（9－14个GATC）

8个GATC较保守,CATC中的“A”已甲基化;（3）具有4个反向重复顺序，作为蛋白结合位点；（4）此顺序的右侧毗邻区域有两个起动子，其可能的作用是：①转录产生引物；②产生复制必要的蛋白；③产生调节功能的RN