食品卫生微生物学检验

食品卫生微生物学检验1、总则

食品安全关系到每一个消费者的健康和利益，对国家的经济发展和社会稳定具有重大意义。特别是近年来，伴随着经济全球化的进程，全球性食品贸易的快速增长及世界各国人民的饮食习惯各有不同，因此在相互贸易中，易产生认识上的差异，致使国际间的贸易，常常发生摩擦。为了改善这种情况近年来世界各国政府、国际组织等积极创造条件，提出各种建议，进行交流，以期达到渐趋一致的目的。相关体系国际微生物学会（IAMS）国际食品微生物规格委员会(ICMSF)世界粮农组织(FAO)美国食品药品管理局（FDA）1范围本标准规定了食品卫生微生物学检验总则。本标准适用于各类食品样品的采样。第2页,共31页，2024年2月25日，星期天2、菌落总数测定

1、范围本标准规定了食品中菌落总数的测定方法。本标准适用于各类食品中菌落总数的测定。2、规范性引用文件。第3页,共31页，2024年2月25日，星期天2、菌落总数测定3术语和定义菌落总数食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度和时间、PH、需氧性质等）所得1ml（g）检样中所含菌落的总数。本方法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温需氧的菌落总数。菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。

cfu：colony-formingunits菌落形成单位，一个细菌在平板计数琼脂培养基上生长形成肉眼可见的菌落。第4页,共31页，2024年2月25日，星期天2、菌落总数测定4、设备和材料第5页,共31页，2024年2月25日，星期天2、菌落总数测定8菌落总数测定中的一些要求和规定（1）检验中所用器皿灭菌前彻底洗涤干净。（2）稀释液可用灭菌生理盐水、蒸馏水或磷酸盐缓冲稀释液。（3）样品处理

A、液体样品要充分混匀。含二氧化碳的酒类和饮料，要打开待气体全部逸出后方可检验。酸性样品用1mol/LNaoH,碱性样品用1mol/LHcl调节PH7.0-7.2。

B、固体样品，含盐分高的食品用无盐稀释液，鱼、肉类样品用菌质器研磨均匀（4）空白对照

A、样品所用的稀释液，每批都要有空白对照。

B、有颗粒的食品（特别是10-1的稀释液）可同时作一块平皿4℃环境放置，计数时用作对照。

C、做样品的同时净化室或净化台空气暴露时间作一块平皿对照。（5）培养温度、时间样品加入营养琼脂凝固后，一定要翻转平皿放36℃培养48小时，鱼、虾类水产品生活环境水温较低，多采用30℃培养72小时。（6）菌落计数选取30-300之间作为测定标准，1个稀释度取2个平板取平均数，如果平板上出现链状菌落，一条链为一个菌落，来源不同的几条链每条为一菌落。如乳酸杆菌和酵母菌应排除不计。

(7)稀释度的选择a选取30-300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告b2个稀释度都在30-300之间的视二者之比报告，比值＞2报告其中较小的数，比值≤2报告其平均数。c所有的稀释度平均数都＜30，按稀释度最低的报告。d所有的稀释度均无细菌生长，结果＜1，乘以稀释倍数报告。e如果几个稀释度都多不可计，按稀释度最高的乘以稀释倍数报告。(8)菌落数的报告（见表）

第6页,共31页，2024年2月25日，星期天大肠菌群大肠菌群测定GB/T4789.3-20031范围2规范性引用文件3术语与定义4设备和材料5培养基和试剂6检验程序7操作步骤8大肠菌群测定中的一些要求和规定第7页,共31页，2024年2月25日，星期天大肠菌群

1、范围本标准规定了食品中大肠菌群的测定方法。本标准适用于各类食品中大肠菌群的测定。2、规范性引用文件3、术语与定义下列术语和定义适用于本标准大肠菌群：一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中大肠菌群数系以100ml(g)检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示第8页,共31页，2024年2月25日，星期天大肠菌群测定7操作步骤（1）样品稀释（2）乳糖发酵试验（3）分离培养（4）证实试验（5）结果报告第9页,共31页，2024年2月25日，星期天大肠菌群测定

8大肠菌群测定中的一些要求和规定（1）检验步骤（2）抑菌剂（3）挑选菌落（4）产气量（5）MPN检索表第10页,共31页，2024年2月25日，星期天大肠菌群

菌落色泽与检出率的关系培养基

黑紫色有金属光泽无金属光泽

粉红色粉色EMB平板30/30(100)133/153(86.9)53/95(55.8)37/69(53.6)第11页,共31页，2024年2月25日，星期天粪大肠菌群测定

定义：系指一群在44.5℃条件下能发酵乳糖，产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。第12页,共31页，2024年2月25日，星期天粪大肠菌群测定

操作程序：乳糖胆盐发酵管产气→转种EC肉汤44.5℃24±2h→产气管划线转种EMB平皿36℃18~24h→有典型菌落者，证实为粪大肠菌群阳性。第13页,共31页，2024年2月25日，星期天大肠杆菌大肠杆菌测定1初发酵2复发酵3平板分离4营养琼脂斜面5生化实验6结果报告第14页,共31页，2024年2月25日，星期天大肠杆菌

革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在。

第15页,共31页，2024年2月25日，星期天染色法、培养基和试剂细菌的染色常用染料人工合成含苯的化合物，带有染色基团及助色基团。染色基团可使细菌着色，助色基团增加两者之间的亲和力决定染料的酸碱性。

碱性染料：结晶紫、美兰、碱性复红。酸性染料：伊红、刚果红。中性染料：姬母萨、瑞氏。第16页,共31页，2024年2月25日，星期天常用染色方法简单染色第17页,共31页，2024年2月25日，星期天常用染色方法复合染色第18页,共31页，2024年2月25日，星期天特殊染色第19页,共31页，2024年2月25日，星期天①革兰氏染色法：革兰氏染色法是细菌细胞的复合染色法，由丹麦医生HansChristianGram于1884年创立的染色方法，它包括初染、媒染、脱色、复染较复杂的鉴别染色。基本步骤：涂片固定——结晶紫初染1min——碘液媒染1min——95%乙醇脱色0.5min——沙黄复染1min结果:

革兰氏阳性菌——紫色；

革兰氏阴性菌——红色。第20页,共31页，2024年2月25日，星期天

影响革兰氏染色因素操作技术因素染液的因素细菌自身因素第21页,共31页，2024年2月25日，星期天

革兰氏染色的结果，可受许多因素影响，造成错误的染色反映，导致错误的鉴定结果。(1)操作技术因素

涂片不要过厚，应保持细菌分散均匀，固定时应避免菌体过分受热，脱色时间应反复实践积累经验，根据标本性质而灵活掌握。一般以流下的脱色剂不带有颜色即可。(2)染液的因素

所用染液均应防止水分蒸发而影响浓度，特别是碘液存放太久或受光的作用而形成碘酸，而失去媒染的作用，故应保存于棕色磨口滴瓶中，若发现碘色已淡则应弃取。脱色酒精浓度95%为好，如果浓度不够或涂片上积水过多均可影响脱色不好。(3)细菌本身因素

注意菌龄，一般以18-24h培养效果较好，如细菌过于衰老或死亡，G+菌结果可呈G-菌反应。

影响革兰氏染色因素第22页,共31页，2024年2月25日，星期天培养基

根据各种微生物生长的需要，用人工的方法将多种营养物质配合制成的一种混合营养料。第23页,共31页，2024年2月25日，星期天

配制培养基的原则

根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基，如自型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物质组成。异养微生物的培养基至少需要含有一种有机物质。按微生物的主要类群来说，又有细菌、放线菌、酵母菌和霉菌之分。它们所需要的培养基成分也不同，分别称为牛肉膏蛋白胨培养基，合成培养基，麦芽汁培养基等。第24页,共31页，2024年2月25日，星期天营养物质的浓度与配比

营养物的浓度：在一般情况下，浓度合适的营养物质才对微生物表现出良好作用，浓度大时对微生物生长起抑制作用，浓度小时不能满足微生物生长的需要。各营养物质之间的浓度比：培养基中各营养物质之间的浓度比直接影响微生物的生长与繁殖和（或）代谢产物的形成与积累，尤其是碳氮比（C／N）（碳氮比一般指培养基中元素碳与元素氮的比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白两种成分含量之比）的影响更为明显。例如在微生物的谷氨酸发酵中，培养基的C／N为4：l时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；当C／N为3：1时，菌体繁殖受到抑制，而谷氨酸大量增加。第25页,共31页，2024年2月25日，星期天控制培养基的PH值各类微生物生长的最适pH各不相同，细菌与放线菌生长的pH在7—7.5之间，酵母菌与霉菌生长的pH值在4-5之间。在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，常会改变培养基的pH值，为了维持培养基pH值的相对恒定，通常采用下列两种方式：内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调节培养基的碳氮比。外源调节：按实际需要加酸或加碱。第26页,共31页，2024年2月25日，星期天培养基的种类按培养基的物理状态分类按培养基的功能分类按培养基的组成成分分类第27页,共31页，2024年2月25日，星期天培养基的物理状态

液体培养基：液体培养基不含任何凝固剂，它常用于大规模的工业生产以及在实验室进行微生物生理代谢等基本理论的研究工作。半固体培养基：在液体培养基中加入0.2-0.7％的琼脂构成的培养基。常用来观察细菌运动的特征，以进行菌种鉴定和噬菌体效价滴定等方面的实验工作。

固体培养基：在液体培养基中加入1.5-2.0%的凝固剂制成的呈固体状态的培养基。常用于微生物的分离、纯化、计数等方面的研究。科研与生产中常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅胶三种，除在液体培养基中加入凝固剂之外，一些由天然的固体基质制成的培养基也属于固体培养基第28页,共31页，2024年2月25日，星期天培养基的用途及功能1、基础培养基:含有细菌生长的基本营养成分，碳源、氮源及生长素，最常用的是肉浸液。

2、营养培养基：营养培养基是指在基础培养基里加过葡萄糖、血液和生长因子等一些特殊成分，常用是血琼脂平板。3、鉴别培养基：培养基中加入特定的作用底物指示剂，利用细菌分解糖类和蛋白质的能力及代谢产物的不同来鉴别细菌。4、选择培养基：培养基中加入某种化学物质及抗生素，抑制一些细菌生长，有助于需要的细菌种类的生长。5、特殊培养基：包括厌氧菌培养和细菌L型培养，加入合适的营养成分及还原剂等。第29页,共31页，2024年2月25日，星期天培养基组成成分

合成培养基：由化学成分完全了解的物质配制而成的培养基，该类培养基的组成成分精确、重复性强，但微生物生长较慢，且价格昂贵，故一般适于在实验室范围内，研究生物营养需要、代谢、分类鉴定、生物测定以及菌种选育、遗传分析等方面的研究工作。天然培养基：利用化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物质(豆芽汁、玉米粉、牛奶、血清等）制成的培养基，天然培养基比较经济，除实验室经常使用外，更适宜于在生产上用来大规模地培养微生物和生产微生物产品。第30页,共31页，2024年2月25日，星期天培养基的基本成分1、1，营养物质（1）蛋白胨氮源，是动物或植物