色谱技术亲和色谱

色谱技术亲和色谱常见亲合作用体系特异性亲和体系高特异性抗原-单克隆抗体荷尔蒙－受体蛋白核酸－互补碱基链段、核酸结合蛋白酶－底物、产物、抑制剂群特异性免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白酶－辅酶凝集素－糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体酶、蛋白质-肝素酶、蛋白质-活性色素（染料）酶、蛋白质-过渡金属离子（铜、锌等）酶、蛋白质－氨基酸（组氨酸等）第2页,共69页，2024年2月25日，星期天第3页,共69页，2024年2月25日，星期天1、离子强度：一般来说，提高离子强度，亲和作用减弱或完成破坏。2、PH：在适当的PH下，亲和结合作用较高，在其它PH下，亲和作用减弱或完成破坏。3、抑制氢键形成的物质：脲和盐酸胍的存在可减弱亲和作用4、温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱；但是，疏水性相互作用增强5、液体离子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用减弱6、螯合剂：影响配位键，使亲和作用消失影响亲和作用的因素第4页,共69页，2024年2月25日，星期天利用生物分子之间的专一性识别或特定的相互作用进行分离的技术为亲和分离技术亲和配基是对生物分子具有专一性识别或特定的相互作用的物质第5页,共69页，2024年2月25日，星期天6找与底物专一可逆结合的配基；将配基通过共价键偶联到基质；配基与底物吸附；洗脱目标物。

第6页,共69页，2024年2月25日，星期天7亲和纯化技术亲和层析(Affinitychromatography)亲和过滤（膜分离）亲和分配（双水相萃取）亲和反胶团萃取（反胶团萃取）亲和沉淀（沉淀）亲和电泳（电泳）第7页,共69页，2024年2月25日，星期天第8页,共69页，2024年2月25日，星期天配基生物特异性配基拟生物亲和配基亲和配基必须具备的条件：1、专一性识别或特异性作用必须是可逆的2、结合常数要适当3、稳定性好，可进行化学改性第9页,共69页，2024年2月25日，星期天专一性和特异性决定着分离纯化的产品纯度相互作用的强弱决定着吸附和解吸的难易程度第10页,共69页，2024年2月25日，星期天亲和配基的分类单专一性的小分子配基基团专一性的小分子亲和配基专一性的大分子亲和配基免疫亲和配基基团专一性的大分子亲和配基第11页,共69页，2024年2月25日，星期天亲和配基的选择组合化学肽库选择亲和配基目标肽→反义肽→组合合成→亲和筛选→优选序列噬菌体展示技术目标蛋白→可结合噬菌体→扩增→多轮筛选单克隆群体→氨基酸序列SELEX技术随机序列→PCR扩增→特异性结合→重复筛选第12页,共69页，2024年2月25日，星期天亲和洗脱目标产物的洗脱方法有特异性洗脱和非特异性洗脱。特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，洗脱目标产物。非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH、离子强度、离子种类或温度等降低目标产物的亲和吸附作用。第13页,共69页，2024年2月25日，星期天亲和色谱亲和层析(AffinityChromatography，AC)是利用生物大分子具有对一类生物大分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离的色谱方法，也叫做生物亲和或生物特异性亲和色谱。是亲和分离技术中最具优势的方法第14页,共69页，2024年2月25日，星期天含配体溶液收集目的蛋白

洗下未结合的蛋白混合蛋白样品平衡液带有配体的树脂珠（或胶粒）第15页,共69页，2024年2月25日，星期天第16页,共69页，2024年2月25日，星期天亲和层析的基本特点1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子3、纯化倍数大，产物纯度高4、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件5、价格相对较昂贵；6、在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并进入产品中，从而造成不良影响，如抗体、染料等配基。第17页,共69页，2024年2月25日，星期天基质的选择理想的基质应符合下面的要求：1．极低的非特异性吸附。2．高度的亲水性。3．较好的理化稳定性。4．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合。5．适当的多孔性。一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻璃珠等。亲和色谱介质的制备第18页,共69页，2024年2月25日，星期天配基的选择

根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异性配体（specificligand）和通用性配体（generalligand）。特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶和它的抑制剂、激素－受体等，它们结合都具有很高的特异性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的特异性是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻找特异性配体一般是比较困难的，尤其对于一些性质不很了解的生物大分子，要找到合适的特异性配体通常需要大量的实验。

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通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种凝集素（lectine）可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合RNA、结合RNA的蛋白质等。通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得到了广泛的应用。

第20页,共69页，2024年2月25日，星期天21配基的浓度

对亲和势比较低的时候（KL≥10-4mol/L），增加配基浓度有利于吸附。增加亲和柱的长度来提高吸附率。配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。理想的配基浓度为1-10μmol/L。第21页,共69页，2024年2月25日，星期天22配基偶联的位置配基固定化时，其不参与亲和结合的部位与载体进行偶联。腺嘌呤N6-氨基接到载体上，对脱氢酶和甘油激酶有吸附力。磷酸基接到载体上，对甘油醛-3-磷酸脱氢酶有吸附力。第22页,共69页，2024年2月25日，星期天23配基分子的大小

选用大分子配基。小分子物质作为配基，载体和配基间插入一个“手臂”以消除空间障碍。第23页,共69页，2024年2月25日，星期天亲和吸附介质的配基

（1）酶的抑制剂一些物质，它们并不引起酶蛋白变性，但能使酶分子上的某些必需基团（主要是指酶活性中心上的一些基团）发生变化，因而引起酶活力下降，甚至丧失，致使酶反应速度降低，能引起这类抑制作用的物质称为酶的抑制剂（inhibitor）。

在生物体内蛋白酶的抑制剂可与蛋白酶的活性部位结合，抑制酶的活性，必要时保护生物组织不受蛋白酶的损害。酶的抑制剂在分子大小和形态上分布较广，有天然的生物大分子，也有小分子化合物。第24页,共69页，2024年2月25日，星期天

（2）抗体利用抗体为配基的亲和层析又称为免疫亲和层析（Immunoaffinitychromatography）。抗体与抗原之间具有高度特异性结合能力，结合常数一般为107～1012L/mol。因此，利用免疫亲和层析法，特别是以单抗为配基的免疫亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。

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（3）A蛋白

A蛋白（proteinA）为分子量约42KD的蛋白质，存在于黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的细胞壁中，占该细胞壁构成成分约5％。A蛋白在确定其为蛋白质之前称A抗原，与动物免疫球蛋白G(immunogloblinG，IgG)具有很强的亲和结合作用，结合部位IgG分子的Fc片断（Y字型IgG分子的主干部分）

A蛋白不与抗体（IgG）的抗原结合部位结合，而且任何抗体的Fc片断的结构都非常相似，因此A蛋白可作为各种抗体的亲和配基，但不同抗体的结合常数有所不同。第26页,共69页，2024年2月25日，星期天

（4）凝集素

凝集素(lectin)是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的总称，大部分凝集素为多聚体，含有两个以上的糖结合部位，不同的凝集素与糖结合的特异性不同。例如，常用做亲和配基的伴刀豆球蛋白A(concanavalinA，conA)与葡聚糖和甘露糖的亲和结合作用较强，而麦芽糖凝集素（wheatgermagglutinin，WGA）与N-乙酰葡糖胺（N-acetyl-glucosamine）的亲和结合作用较强。

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（5）辅酶和磷酸酰苷各种脱氢酶和激酶需要在辅酶（coenzyme）的存在下表现其生物催化活性，即脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和作用。辅酶主要有辅酶Ⅰ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，nicotinamideadeninedinucleotide，NAD）、辅酶Ⅱ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADphosophate，NADP）和三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）等。这些辅酶可用做脱氢酶和激酶的亲和配基。此外，磷酸腺苷（adenosine5’-monophosphate，AMP）、二磷酸腺苷（adenosine2’，5’-diphosphate，ADP）的腺苷部分与上述辅酶的结构类似，与脱氢酶和激酶同样具有亲和结合作用，可用做这些酶的亲和配基。第28页,共69页，2024年2月25日，星期天

（6）过渡金属离子

Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+等过渡金属离子可与N、S和O等供电原子（electrondonoratom）产生配位键，因此可与蛋白质表面的组氨酸（His）的咪唑基、半胱氨酸（Cys）的巯基和色氨酸（Trp）的吲哚基发生亲和结合作用，其中以His的咪唑基的结合作用最强。过渡金属离子与咪唑基的结合强弱顺序是Cu2+＞Ni2+＞Zn2+≥Co2+。第29页,共69页，2024年2月25日，星期天

（7）组氨酸在各种氨基酸中，组氨酸的性质比较独特：具有弱疏水性、咪唑环为弱电性。因此组氨酸可与蛋白质发生亲和结合作用。虽然这种亲和作用的机理尚不十分清楚，但利用固定化组氨酸吸附蛋白质以及吸附蛋白的洗脱实验结果表明，静电和疏水性相互作用均有可能参与亲和结合。在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质等电点的溶液中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着盐浓度增大，亲和吸附作用降低。因此利用组氨酸为配基可亲和分离等电点相差较大的蛋白质，洗脱则可采用增大盐浓度的梯度洗脱法。第30页,共69页，2024年2月25日，星期天

（8）肝素肝素（heparin）是存在于哺乳动物的肝、肺、肠等脏器中的酸性多糖类物质，分子量一般为5～30KD，具有抗凝血作用。肝素与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等具有亲和作用，可用作这些物质的亲和配基。肝素的亲和结合作用在中性pH和低浓度盐溶液中较强，随着盐浓度的增大结合作用降低第31页,共69页，2024年2月25日，星期天活化

基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。

溴化氰活化法

溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨(NH2)反应，主要生成异脲衍生物。反应如下：

介质活化与耦联第32页,共69页，2024年2月25日，星期天活化耦联过程20ml、2mol/L碳酸氢钠+20g湿琼脂糖，冰浴4-5min搅拌过程中加入溴化氰，4-5℃10min过滤，冷蒸馏水和缓冲液洗涤加入溶于缓冲液中的配基，搅拌2h，4℃保存第33页,共69页，2024年2月25日，星期天

这种方法的缺点是溴化氰活化法的基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基的pKa＝10.4，所以通常会带一定的正电荷，从而使基质可能有阴离子离子交换作用，增大了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。另外溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，尤其是当与小配体结合时，可能会出现配体脱落现象。另外溴化氰有剧毒、易挥发，所以操作不便。

第34页,共69页，2024年2月25日，星期天环氧基活化法在热的浓碱溶液中，多糖类化合物与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物；在碱性条件下，其环氧化合物又能与氨基酸或蛋白质上氨基偶联。第35页,共69页，2024年2月25日，星期天

这种活化方法的优点是活化后不引入电荷基团，而且基质与配体形成的N－C、O－C和S－C键都很稳定，所以配体与基质结合紧密，亲和吸附剂使用寿命长，而且便于在亲和层析中使用较强烈的洗脱手段，另外这种处理方法没有溴化氰的毒性。它的缺点是用环氧氯丙烷活化的基质在与配体偶联时需要碱性条件，pH为9-13，温度为20-40℃。这样的条件对于一些比较敏感的配体可能不适用。上面两种方法是比较常用的方法。另外还有甲苯磺酰氯法、双功能试剂法。第36页,共69页，2024年2月25日，星期天亲和配基耦联密度测定

耦联密度决定了介质的吸附容量分光光度法量差法分析水解作用分析元素分析法第37页,共69页，2024年2月25日，星期天间臂分子当配基的分子量较小时，将其直接固定在载体上，会由于载体的空间位阻，配基与生物大分子不能发生有效的亲和吸附作用。如果在配基与载体之间连接间隔臂，可以增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子发生有效的亲和结合。第38页,共69页，2024年2月25日，星期天加入间臂的长度要恰当，太短则效果不明显；太长则容易由疏水性非特异吸附造成弯曲，反而降低吸附效率。间臂的疏水性也需要考虑，应尽量减小对配基的影响。如间臂和配基疏水性较强，则效果不明显。第39页,共69页，2024年2月25日，星期天第40页,共69页，2024年2月25日，星期天常见的亲和色谱核苷酸及辅酶亲和色谱固定化金属离子亲和色谱染料亲和色谱免疫亲和色谱基团专一性大分子亲和色谱第41页,共69页，2024年2月25日，星期天核苷酸及辅酶亲和色谱指将核苷酸（或辅酶）作为亲和配基固定在色谱介质上进行亲和色谱的技术，主要利用核苷酸特别是辅酶因子和蛋白质之间的专一性识别达到分离纯化目的第42页,共69页，2024年2月25日，星期天第43页,共69页，2024年2月25日，星期天介质制备碳二亚胺直接法偶联溴化氢活化琼脂糖→连接氨基己酸→加入核苷酸→溶液中保存→洗涤→偶联间接偶联法间臂分子和核苷酸→活化的介质第44页,共69页，2024年2月25日，星期天吸附和解吸选择合适的缓冲液条件下吸附一般采用辅酶或盐溶液进行梯度洗脱第45页,共69页，2024年2月25日，星期天固定化金属离子亲和色谱蛋白质上的氨基酸残基，如组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，有利于蛋白质与固定化金属离子结合，从而达到分离的目的。金属离子如锌和铜。第46页,共69页，2024年2月25日，星期天47将活化的介质与金属螯合剂偶联，再用金属离子溶液处理制成金属螯合亲和层析柱。金属螯合剂：亚氨二醋酸、氨基水杨酸、8-羟基喹啉、羧甲基氨基酸等

.第47页,共69页，2024年2月25日，星期天亲和作用机理静电作用配位键结合共价键生产π键第48页,共69页，2024年2月25日，星期天吸附采用50mmol/L的金属盐溶液通过色谱柱，直至色谱介质吸附饱和。平衡缓冲溶液洗去未螯合的金属离子加入适宜浓度的NaCl和选择合适pH值有利于减少非特异性吸附。第49页,共69页，2024年2月25日，星期天解吸吸附蛋白质解吸的方法：改变pH值竞争性洗脱采用50-100mmol/L的EDTA洗脱，可将蛋白质和金属离子解吸，洗涤，重新上柱平衡，固定所需的金属离子。第50页,共69页，2024年2月25日，星期天pH与氯化铵浓度的影响第51页,共69页，2024年2月25日，星期天固定化亲和离子色谱的应用基因修饰蛋白质的纯化遗传修饰→具亲和尾蛋白→色谱分离→亲和尾切除→色谱分离酶切位点亲和尾大小第52页,共69页，2024年2月25日，星期天53染料亲和色谱有机染料具有类似于NAD+的结构。需核苷酸类物质为辅酶的酶，对染料具有一定亲和力。染料共价偶联到琼脂糖载体上，能制得亲和层析柱。染料亲和层析已成功的分离纯化了多种酶。第53页,共69页，2024年2月25日，星期天第54页,共69页，2024年2月25日，星期天染料亲和色谱介质的制备配基性质、染料结构和染料取代度是制备过程中需要考虑的主要因素。以下途径可以实现制备：采用琼脂糖凝胶，染料连接在-OH上，该过程可在一定条件下直接完成。染料也可通过活性基团和基质偶联，该方法可引入高密度的染料。第55页,共69页，2024年2月25日，星期天吸附蛋白质量增多选择亲和作用力较小的染料有利于解吸第56页,共69页，2024年2月25日，星期天吸附与解吸采用磷酸盐缓冲液，在pH6.0-7.0条件下吸附常用解吸方法：增加盐浓度改变pH值采用水溶性高聚物亲和洗脱最后对杂蛋白进行变性处理，洗涤、缓冲液平衡再生介质。第57页,共69页，2024年2月25日，星期天免疫亲和色谱抗原和抗体的作用具有高度的专一性,并且它们的结合亲和力极强。因此用适当的方法将抗原或抗体结合到吸附剂上,便可有效地分离和纯化免疫物质。特点：分离效率高，成本高，而且蛋白质亲和配基不稳定，容易降解。第58页,共69页，2024年2月25日，星期天免疫亲和色谱过程目标蛋白质抗体制备上样与洗脱介质制备第59页,共69页，2024年2月25日，星期天单抗制备复杂，成本高，但也具有很多优点。第60页,共69页，2024年2月25日，星期天色谱介质制备：将抗体通过化学方法结合在色谱介质上抗体之间交联形成不溶性衍生物第61页,共