我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析

我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析狂犬病是由狂犬病病毒（Rabiesvirus，RV）引起的人兽共患疾病，一旦发病，几乎100％死亡，疫苗接种是预防该病的重要措施。目前，我国人用狂犬病疫苗生产用毒株主要有aG、CTN-1V和PV2061株，其中aG株和CTN-1V株为我国自行分离并传代适应，PV2061株来源于法国巴斯德株。上述病毒株生产的人用狂犬病疫苗经临床应用显示，具有良好的保护效果。

我国人用狂犬病疫苗生产用原始种子4aGV、CTN-1V、PV2061株病毒糖蛋白（Glycoprotein，G）全基因序列进行测定，分析3株病毒糖蛋白氨基酸序列的同源性1.材料与方法

1.1菌毒株

狂犬病病毒原始种子批4aGV、CTN-1V和PV2061均由中国食品药品检定研究院病毒一室保存；感受态大肠杆菌DH5α。

1.2主要试剂

QIAampViralRNAMiniKit

ReverseTranscriptionSystem

TaKaRaLATaq誖DRR002A

EZNA誖GelExtractionKit

pGEM-Tvectorsystem1.3引物设计及合成

根据GenBank中登录的aG、CTN、PV株病毒M、L区基因序列，应用PrimerPremier5.0软件设计位于M区及L区的上下游引物，见表1。1.4病毒G区基因的扩增

用QIAampViralRNAMiniKit提取病毒RNA，

ReverseTranscriptionSystem提供的随机引物逆转录

合成cDNA第一链，再以其为模板，PCR扩增目的基因。

反应体系为：cDNA2μl，10×buffer5μl，2.5mmol／L

dNTP4μl，上下游引物各2μl（10pmol／L），LATaq

1μl，去离子水补足体积至50μl。反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，53℃30s，72℃2min，共30个循环；72℃再延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖

凝胶电泳鉴定，EZNA誖GelExtractionKit纯化回收。1.5克隆测序

将PCR纯化产物与pGEM-Tvector连接，转化

感受态大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选阳性克隆，经菌落PCR鉴定后，送北京三博远志生物技术有限公司测序，每个片段至少送6个阳性克隆。1.6病毒糖蛋白生物信息学分析

应用DNAstar中的MegAlign软件分析3株病

毒糖蛋白基因序列及氨基酸序列的同源性；应用

AntheProt5.0及DNAstar中的Protean软件分析3株病毒糖蛋白的结构及潜在B细胞抗原表位的差

异。2.结果2.1病毒G区基因扩增产物的鉴定应用配对引物分别扩增4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒G区基因，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，均可见约2300bp的特异条带，大小与预期相符；应用3对引物分别扩增4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒G区基因，仅配对引物扩增出相应条带。尽管应用aG-MGL-F／R引物对PV2061株病毒G区基因进行扩增时有条带出现，但该条带大小及扩增产物浓度均与目的片段明显不符，为非特异性扩增。因此3对引物均具有特异性，与其他毒株无特异性配对。见图1。图1

4aGV、CTN-1V、PV2061株病毒糖蛋白基因扩增产

物电泳图2.2

4aGV、CTN-1V、PV2061株病毒糖蛋白基因序列同源性分析4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白测序结果已提交到GenBank，登录号分别为JN234411、JN234418和JN234424。测序结果表明，3株病毒均为基因Ⅰ型狂犬病病毒；其基因组M-G区间序列长度均为5bp，CTN-1V株M-G区间序列为CTTTT，4aGV与PV2061株为CTATT；3株病毒G区全序列均具有5′端AACA和3′端polyA尾结构，其中CTN-1V、4aGV株G区基因长度为2067bp，PV2061株为1675bp，基因同源性为76.0％～88.4％；3株病毒G区ORF基因均为1575bp，基因同源性为84.4％～91.5％；CTN-1V、4aGV株G-L区间序列长度为24bp，PV2061株为423bp。对推导的3株病毒糖蛋白氨基酸序列的同源性分析表明，3株病毒糖蛋白均由524个氨基酸组成，同源性为90.5％～92.2％，见表2。2.3糖蛋白信号肽分析

对4aGV、CTN-1V和PV2061株的糖蛋白信号肽分析发现，三者前19位氨基酸均存在潜在信号肽结构，其中第19位氨基酸为三者潜在信号肽断裂位点，4aGV株病毒糖蛋白第17位氨基酸为潜在信号肽断裂位点，见图2。2.4糖蛋白跨膜区结构分析对4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白氨基酸结构进行跨膜区域分析，结果显示，3株病毒糖蛋白分别在第463～476、464～475及463～475位氨基酸存在潜在可折叠螺旋的疏水性区域，可判断为明显跨膜区域，见图3。图3

4aGV（A）、CTN-1V（B）和PV2061株（C）糖蛋白潜在跨膜区域预测

2.5糖蛋白的二级结构预测

应用AntheProt5.0软件中的Gibrat法对4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白二级结构进行预测，结果显示，4aGV、CTN-1V和PV2061株糖蛋白氨基酸残基均富含潜在α螺旋、β折叠及卷曲结构，其比例分别为30％、31％、39％，28％、30％、41％和29％、30％、41％，3株病毒糖蛋白发生扭曲、折叠的几率较高，易形成丰富的二级结构，见图4。2.6糖蛋白B细胞抗原表位预测结合4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白一级、二级及局部特殊结构，选取各株病毒糖蛋白亲水性强，无α螺旋、β片层规则结构，并具有β转角的可塑性较大区域及表面可能性和抗原指数高的区域，分别得到3株病毒株糖蛋白潜在B细胞抗原表位区域，三者表位位置与数量相似，见图5和表3。信号肽结构常指新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移（定位）的N-末端氨基酸序列，其至少含有1个带正电荷的氨基酸，中部有一高度疏水区以通过细胞膜，并具有种属特异性。4aGV、CTN-1V、PV2061株病毒在N-末端前19位氨基酸均存在潜在信号肽结构，可引导病毒糖蛋白在细胞膜上表达。此外，3株病毒潜在信号肽结构氨基酸同源性仅为78.9％～94.7％，这可能是在传代减毒过程中，病毒对不同传代基质细胞的适应表征，反过来也间接影响了3株病毒在Vero细胞中的适应程度。Benmansour等［11］通过对中和单克隆抗体逃逸株点突变的研究，对糖蛋白的中和抗原位点进行了初步定位，证明了糖蛋白含有3个中和抗原位点，且均为空间依赖型抗原位点，但目前仍缺乏病毒糖蛋白线性表位的研究资料，因此本研究对4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白二级结构进行了深入分析，结果显示，3株病毒糖蛋白均易发生扭曲、折叠，在多个区域存在α螺旋、β折叠及卷曲结构，形成丰富的二级结构，并在多个位点存在潜在B细胞抗原位点。尽管目前尚无准确率较高的抗原位点预测方法，但本研究的分析结果仍可作为确定糖蛋白潜在优势表位的参考。此外，本研究应用特异性引物扩增不同株病毒糖蛋白全基因，并结合相应糖蛋白编码区序列的同源性分析，可初步实现病毒株的快速鉴定。研究结果4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒均属基因Ⅰ型狂犬病病毒；其糖蛋白G区基因同源性为76.0％～88.4％，G区ORF基因同源性为84.4％～91.5％，氨基酸序列同源性为90.5％～92.2％；3株病毒糖蛋白前19位氨基酸中均存在潜在信号肽结构，其中第19位氨基酸为三者潜在信号肽断裂位点，第17位氨基酸为4aGV株病毒糖蛋白潜在信号肽断裂位点；3株病毒糖蛋白分别在第463～476、464～475及463～475位氨基酸存在潜在可折叠螺旋的疏水性区域，为明显跨膜区域；

4aGV、CTN-1V和PV2061株病毒糖蛋白氨基酸残基均富含潜在α螺旋、β折叠及卷曲结构，其比例分别为30％、31％、39％，28％、30％、41％和29％、30％、41％，易发生扭曲、折叠，形成丰富的二级结构；

3株病毒糖蛋白潜在B细胞抗原表位位置与数量相似

糖蛋白