第七章 培养细胞中克隆基因的表达课件

第七章：培养细胞中克隆基因的表达及动物基因工程第七章培养细胞中克隆基因的表达本章概述基因调控的研究（有关原核和真核生物的表达载体、报告基因等）基因在细胞系中表达的方法筛选阳性转基因动物细胞的遗传标记哺乳动物中瞬时转化载体（以SV40为例）基因定点敲除技术第七章培养细胞中克隆基因的表达第一节基因调控的研究一、表达载体一类在多克隆位点的5‘端含有转录启动子的克隆载体。由于真核生物和原核生物启动子的不同，需要针对不同的宿主设计不同的载体。第七章培养细胞中克隆基因的表达A、在大肠杆菌中的外源基因表达载体(1)典型的原核基因以及其RNA的特点第七章培养细胞中克隆基因的表达转录终止序列

GC-richinvertedrepeat5’-GTCAAAAGCCTCCGGTCGGAGGCTTTTGACT

CAGTTTTCGGAGGCCAGCCTCCGAAAACTGA-5’RunofAresidues依赖ρ因子的终止子不依赖ρ因子的终止子第七章培养细胞中克隆基因的表达真核基因的启动子不能被原核RNA聚合酶识别真核基因在原核生物中表达，必须把基因序列置于原核基因的框架内.(2)真核基因和原核基因的区别第七章培养细胞中克隆基因的表达(3)启动子是表达载体的关键部分——选择启动子

······TTGACA

·····························TATAAT

····GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATATTGTCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTACGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACTGACACTTGATACTGTATGAAGCATACAGTATAATTGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTTAATGT

-35Region-10GegionConsensuslactrpλPLrecAtacItacII-10和-35碱基序列和通序启动子的强弱与它们与共有序列的相似程度有关。相似性越高，就越强；反之。。。。。第七章培养细胞中克隆基因的表达第七章培养细胞中克隆基因的表达序列盒和基因融合在载体上将启动子、核糖体结合位点和终止信号按较合理的置于载体上，这样的序列叫做序列盒外源基因插入在序列盒中间，通常与细菌的一段基因形成融合基因，所以在构建这类载体时，一定需要阅读框的正确。第七章培养细胞中克隆基因的表达融合载体的四大优点：利用大肠杆菌天然序列，可以保证有效地翻译起始防止外源蛋白被降解可以被输出到胞外，利于纯化可以便于亲和层析第七章培养细胞中克隆基因的表达(4)大肠杆菌中高效表达基因的策略优化表达载体的设计提高稀有密码子tRNA的表达作用提高外源基因mRNA的稳定性提高外源基因表达产物的稳定性优化发酵过程第七章培养细胞中克隆基因的表达B、在真核细胞中外源基因表达载体真核生物的启动子序列包含：1）核心元件（TATA盒，起始子等）2）上游元件(CAAT盒等）3）远上游调控(增强子等）第七章培养细胞中克隆基因的表达B、真核生物的表达载体通常含有真核基因的启动子序列表达载体的启动子区基本表达组成型表达细胞特异表达调节型表达MCSTATASP1AP1CAAT细胞特异调节型表达第七章培养细胞中克隆基因的表达二、报告基因报告基因应满足的条件1）编码特异的蛋白酶活性，宿主细胞中没有2）酶活检测应快速、简便、灵敏等3）报告蛋白不影响宿主细胞的正常活性常用的GFP(YFP)、lacZ、GUS等第七章培养细胞中克隆基因的表达第二节基因在细胞中的表达方法第七章培养细胞中克隆基因的表达一、基因转染的策略

一般基因转化的的策略直接转化:用物理的方法直接将外源DNA转进细胞中去。

转染:用一系列物理和化学的方法迫使细胞能从周围的介质中接受DNA。�转导:动物病毒animalvirus第七章培养细胞中克隆基因的表达一、基因转染的策略1.DNA/磷酸钙共沉淀的方法转化过程A、将待转染的DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液B、逐滴加入到Hepes-磷酸盐缓冲液中，形成磷酸钙-DNA共沉淀C、用吸管将共沉淀物加到培养的哺乳动物单层细胞表面，会迅速被细胞捕获，频率约10％第七章培养细胞中克隆基因的表达（二）脂质体介导的转染脂质体(liposomes)是一种人造的脂质小泡，外周是脂双层，内部是水腔一、基因转染的策略第七章培养细胞中克隆基因的表达一、基因转染的策略第七章培养细胞中克隆基因的表达第七章培养细胞中克隆基因的表达（三）电穿孔法在高压电脉冲的作用下使细胞膜上出现微小的孔洞，从而促使不同细胞之间发生原生质体融合或促使细胞吸收外界环境中的DNA分子一、基因转染的策略第七章培养细胞中克隆基因的表达第七章培养细胞中克隆基因的表达（四）、直接转化－微注射真正的显微注射穿刺一、基因转染的策略第七章培养细胞中克隆基因的表达二、瞬时转染（转化）外源DNA不与宿主的基因组DNA整合，转化细胞在较短的时间内进行转录和翻译。常用于较短时间的实验，如启动子功能检测，蛋白质亚细胞定位等第七章培养细胞中克隆基因的表达三、稳定转化外源基因整合到细胞染色体中，随着细胞的分裂而传代（或子代的形成），产生稳定的转基因细胞系（或个体）。通常用于研究基因的功能或改变生物个体的性状。第七章培养细胞中克隆基因的表达第三节：筛选阳性转基因动物细胞的遗传标记第七章培养细胞中克隆基因的表达内源的选择标记这些基因存在于野生型的细胞中只能在相关基因发生了突变（失去功能）的突变体细胞中应用显性的选择标记赋予细胞一个完全新的表型，可以在多个细胞系中进行利用。第七章培养细胞中克隆基因的表达哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记

遗传标记编码产物筛选药物作用机理APH-氨基糖苷磷酸转移酶G418APH灭活G418DHFR二氢叶酸还原酶氨甲喋呤DHFR突变体抗氨甲喋呤HPH-潮霉素B磷酸转移酶 潮霉素BHPH灭活潮霉素BTK-胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤TK合成TMPXGPRT-黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶

霉酚酸XGPRT合成GMPADA-腺嘌呤核苷脱氨酶腺嘌呤木酮糖苷ADA灭活Xyl-A第七章培养细胞中克隆基因的表达第七章培养细胞中克隆基因的表达1.胸苷激酶基因选择系统TK－细胞

把细胞培养在加有胸苷类似物5-溴尿嘧啶脱氧核苷（BUdR）的培养基中，在胸苷激酶（TK）的催化下，BUdR便掺入到细胞的DNA分子上，致使DNA复制出现错误。具有BUdR-DNA的细胞对UV特别敏感，被迅速地杀死，而少数TK－的细胞便能存活下来HAT选择法：在含有次黄嘌呤(Hypoxanthine)、氨基蝶呤(Aminopterin抑制了正常的核苷酸合成)和胸苷(Thymidine)的培养基中筛选TK+细胞第七章培养细胞中克隆基因的表达共转化选择。在磷酸钙沉淀中，有两种形体上没有连接的DNA组成的混合物，能够同时转化受体细胞将无选择标记的DNA与具TK选择标记基因的DNA进行混合转化外源DNA可整合到核基因组的任何部位把TK基因先与非选择标记基因连接起来，也能共转化1.胸苷激酶基因选择系统第七章培养细胞中克隆基因的表达90%的TK+细胞同时含有gene2

第七章培养细胞中克隆基因的表达

2.二氢叶酸还原酶基因选择系统基本原理：

DHFR催化二氢叶酸(DHF)还原成四氢叶酸(THF)氨基蝶呤(aminopterin)和氨甲蝶呤(methotrexate)可与DHFR紧密结合使之失去活性，从而阻断核苷酸生物合成，最终导致细胞死亡第七章培养细胞中克隆基因的表达细胞培养物经氨甲蝶呤处理后，绝大多数细胞死亡，但也可筛选到氨甲蝶呤抗性细胞系◊吸收氨甲蝶呤能力下降的细胞系。由于DHFR基因拷贝数的增加，能超量合成DHFR的细胞系。DHFR结构发生改变，降低了对氨甲蝶呤亲和力的细胞系细胞内扩增DHFR基因时，与该基因邻近的染色体DNA片段同样被扩增外源基因在动物细胞内的高效表达第七章培养细胞中克隆基因的表达第七章培养细胞中克隆基因的表达第七章培养细胞中克隆基因的表达（一、）SV40病毒及其衍生的载体1、SV40病毒猿猴空泡病毒40(SV40)感染猿猴细胞后，裂解细胞，释放感染性的病毒颗粒——PermissivecellSV40感染啮齿动物（仓鼠和小鼠），将病毒基因组整合到寄主的染色体上，不产生感染性颗粒——Non-Permissivecell人体细胞——Semi-Permissivecell第七章培养细胞中克隆基因的表达第四节哺乳动物中瞬时转化载体（以SV40为例）第七章培养细胞中克隆基因的表达1、SV40的生活史SV40是一个大约5.2kb，双链环状整个基因组有两个转录单位,以相反方向转录的早期基因区和晚期基因区两个转录区都能形成多种产物SV40病毒及其衍生的载体第七章培养细胞中克隆基因的表达早期基因：T和t抗原，与病毒的致瘤作用有关，并对病毒DNA复制的起始十分重要晚期基因：VP1、VP2、VP3，编码病毒的衣壳蛋白早期转录产生T抗原和t抗原，在T抗原作用下起始病毒DNA的复制，在DNA复制后，开始晚期转录，表达产生病毒的衣壳蛋白VP1、VP2、VP3，然后装配成病毒颗粒，裂解细胞SV40病毒及其衍生的载体第七章培养细胞中克隆基因的表达

2.SV40载体野生型的SV40病毒颗粒只能包装其基因组大小的DNA用外源DNA取代病毒的早期或晚期基因，在辅助病毒的帮助下形成含有外源DNA的病毒颗粒（一）、SV40病毒及其衍生的载体第七章培养细胞中克隆基因的表达

A、SV40晚期区取代的载体用外源DNA取代SV40晚期基因区用早期基因有缺失的SV40作为辅助病毒将两种DNA共同转染猴细胞，彼此提供基因产物，最后可形成病毒颗粒，一些病毒颗粒中含有外源DNA，一些含有突变的病毒基因。释放的病毒再感染其它的猴细胞，在这一轮感染周期中，外源基因得以高效表达SV40病毒及其衍生的载体第七章培养细胞中克隆基因的表达

B、SV40早期区取代的载体用外源DNA取代SV40早期基因区，利用晚期基因有缺失的SV40作为辅助病毒，将两种DNA共同转染猴细胞COS细胞：将一个复制起点部位缺失的SV40基因组整合到猴细胞的染色体上所形成的细胞系。早期基因表达可产生T和t抗原，但由于没有复制起点，SV40DNA不能复制，也就不能产生晚期基因产物，故COS细胞可积累T抗原用早期取代载体感染cos细胞，在cos细胞所提供的T抗原的帮助下，病毒DNA可进行复制、表达晚期基因，最后可包装成病毒颗粒，在病毒颗粒中只有早期取代载体或其重组DNA分子SV40病毒及其衍生的载体第七章培养细胞中克隆基因的表达C、SV40瞬时表达载体带有SV40复制起点的质粒型表达载体SV40病毒及其衍生的载体第七章培养细胞中克隆基因的表达C、SV40瞬时表达载体该载体可在大肠杆菌细胞内复制可直接转染哺乳动物细胞不通过病毒颗粒的包装，可插入较大的DNA片段转入动物细胞不发生裂解SV40病毒及其衍生的载体第七章培养细胞中克隆基因的表达C、SV40瞬时表达载体当重组DNA分子转入COS细胞后,在cos细胞所提供的T抗原的帮助下，能大量复制,其拷贝数可达20-40万，并高效表达载体上的外源基因由于转染质粒的复制毫无节制地不断进行，直至细胞可能由于无法忍受它的染色体外复制如此大量的DNA而最终死亡，因而这一系统是瞬时表达系统SV40病毒及其衍生的载体第七章培养细胞中克隆基因的表达第五节基因定点敲除技术

（依赖同源重组）

第七章培养细胞中克隆基因的表达ES细胞的基因寻靶（载体类型）插入载体在同源区内线性化，使整个载体插入目的基因位点,打断了目的基因，但也会使选择标记附近的序列重复..第七章培养细胞中克隆基因的表达替换载体在同源区域与目的基因共线性.

转染前在同源区外切割载体成线性。交换会使内源DNA被导入的DNA替换.ES细胞的基因寻靶（载体类型）第七章培养细胞中克隆基因的表达2、选择策略正/负选择方法ES细胞的基因寻靶（阳性细胞选择）第